正交实验优化雄烯二酮-3-乙氧基醚的合成工艺研究

杨春梅 冯书晓

(河南科技大学医院，河南 洛阳 471023；*河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471023)

雄烯二酮(Androstendione, AD，1)是雄甾-4-烯-3,17-二酮的简称，是一种由肾上腺和性腺分泌的19碳的甾体激素，作为生物化学合成雄性激素睾酮和雌性激素雌酮雌二醇的中间产物[1]。近些年来，随着微生物限制性切除甾醇碳17侧链技术的成功[2～5]，使雄烯二酮成为继薯蓣皂素的又一甾体药物合成原料，成为甾体制药企业开发研究的重点[6, 7]。由于雄烯二酮的碳3位和碳17位均含有酮羰基结构，而17位酮羰基常常用于侧链修饰合成甾体激素药物，因此往往需要有选择性的保护3位烯酮结构。

烯醇醚法在甾体药物合成中具有很重要的应用[8，9]，这是由于该反应可以专属地与甾体A环C3-烯酮位点反应[10]，而其它位点如C17-酮基不参与反应，具有条件温和，收率高等优点。烯醇醚保护法具有和缩酮保护法相似的功能，即碱性条件稳定，酸性条件脱保护，但烯醇醚保护法只需一步反应即可实现C3酮羰基的选择性保护(见图1)，相对于缩酮法具有操作简便、反应条件温和、收率高等优点。

图1 雄烯二酮-3-乙氧基醚的合成Fig 1 Synthesis of 3-ethoxy-androstendione

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Bruker Avance 400 MHz核磁共振仪(TMS为内标，德国Bruker公司)；Q-Tof MicroTM高分辨质谱仪(美国waters公司)；XT-4型显微熔点仪(美国Perkin-Elmer 公司)。

雄烯二酮(湖北康宝泰精细化工公司)；原甲酸三乙酯(TEOF)(阿拉丁试剂)；对甲苯磺酸(TsOH·H2O)(国药集团化学试剂)；四氢呋喃(THF)(天津市科密欧化学试剂)；甲苯、丙酮、氯仿及其它试剂均为分析纯。

1.2 绝对乙醇的制备

在装有球形冷凝管(顶端附氯化钙干燥管)的250 mL圆底烧瓶中，加入市售无水乙醇180 mL，金属钠2 g切丝加入，加入磁子，置于磁力加热电热套上加热回流30 min，然后加入邻苯二甲酸二乙酯6 mL，继续回流10 min，将回流装置改为蒸馏装置，尾接管接干燥管，用干燥圆底烧瓶做接受器，蒸馏至几乎无液滴流出为止，用橡胶塞密封，置于干燥器中贮存。检验乙醇是否有水分，可取一支干燥试管，加入绝对乙醇1 mL，立即加入无水硫酸铜粉末少许，如乙醇中含有水分，则无水硫酸铜变为蓝色的五水硫酸铜。

1.3 实验方法

1.3.13-乙氧基-雄甾-3,5-二烯-17-酮的制备方法

称取雄烯二酮(2.00 g，6.98 mmol，1)溶于20 mL新干燥的THF溶液中，并不断搅拌，加入新制的绝对乙醇(A eq.)，原甲酸三乙酯(B eq.)，对甲苯磺酸(C% eq.)，N2保护，反应液在D℃加热E h，TLC跟踪反应(Rf=0.78，PE∶EtOAc=3∶1)；用5 mL 10%NaHCO3溶液稀释，乙醚(3×15 mL)提取3次，橙色层用盐水洗涤(10 mL)，有机层用无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，用含吡啶/乙醇重结晶，得3-乙氧基-雄甾-3,5-二烯-17-酮(3-Ethoxyandrosta-3,5-dien-17-one，2)白色粉末状固体，干燥，称重，计算产率。

1.3.2因素水平表的选择

本实验选择正交实验法对影响雄烯二酮-3-烯醇醚收率的实验因素进行优选，选取L16(45)正交表进行实验。因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.3试验安排表与结果

用L16(45)正交表安排试验，在此正交试验中原料雄烯二酮为6.983mmol, 2.00g，以新蒸四氢呋喃(THF)为溶剂。实验结果见表2。

2 结果与讨论

2.1 烯醇醚保护法的反应机理

烯醇醚保护法一般以原酸酯类或二甲氧基丙烷为反应试剂，以对甲苯磺酸或吡啶酸盐为催化剂在相应醇类试剂中，在比较温和的条件下进行。烯醇醚在非酸性溶剂中稳定，对酸和光照很敏感。利用此特性，烯醇醚的去保护在酸水溶液中或经光照即可完成。该反应的机理如图2所示。

2.2 产品结构解析

产品经柱层析分离，得到3-乙氧基-雄甾-3,5-二烯-17-酮(3-Ethoxyandrosta-3,5-dien-17- one，2)白色粉末状固体。Mp.144-146℃。Rf=0.80(petroleum ether (30-60℃)/EtOAc = 3/2)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.25 (s, 1H, H-6), 5.14(s,1H, H-4), 3.81-3.78(t, 2H,OCH2CH3),2.52-2.45(m, 1H, H-9), 2.32-1.10 (m,16H, skeleton protons), 1.32 (t, 3H, OCH2CH3), 1.02 (s, 3H, H-19), 0.93 (s, 3H, H-18)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 220.98, 154.60, 141.16, 117.07, 98.87, 62.17, 51.94, 48.42, 47.65, 35.84, 35.26, 33.74, 31.50, 31.45, 30.71, 25.45, 21.82, 20.47, 18.97, 14.65, 13.66。ESI-MS, m/z: 315.3[M + H]+，337.3[M + Na]+。HR-MS, m/z: 315.2315[M+H]+(cal. 315.2319)。

2.3 正交实验结果分析

极差直观分析表明：五个因素对产物收率的影响程度分别为：D>A>E>C>B，即影响收率最突出的是反应温度，其次是乙醇的摩尔当量。方差分析结果也证实(见表3)反应温度具有显著性影响。由此确定的最佳反应条件为D2A3E3C2B4：即乙醇量(6eq)2.50 mL，原甲酸三乙酯量(3.0eq)3.50 mL，对甲苯磺酸(1.0%eq)0.012 g，反应温度45 ℃，反应时间4 h。此条件下，产品AD-3-烯醇醚的最高产率可达95.48%。

表2 L16(45)正交实验表Table 2 L16(45) orthogonal design and results

图2 烯醇醚保护法的反应机理Fig 2 Mechanism of the protection method of enol ether

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 验证试验

针对优化出的最佳反应组合，为考查它的可靠性，对最佳工艺条件即各量放大一定的倍数(本实验放大10倍)对其进行验证，进行三次重复性实验(见表4)。验证结果与正交结果相近，说明该工艺稳定、可行。

表4 验证试验Table 4 The verification test

3 结 论

本研究采用正交实验的方法对雄烯二酮-2-乙氧基醚的合成工艺进行了优化，为甾体原料的开发利用奠定了基础，确定最佳合成条件为：乙醇量(6eq)2.50 mL，原甲酸三乙酯量(3.0eq)3.50 mL，对甲苯磺酸(1.0%eq)0.012 g，反应温度45 ℃，反应时间4 h。该工艺稳定、可靠，平均收率达到96.48%，适合工业化应用。

[1] Callow N H, Callow R K. The isolation of androsterone and transdehydroandrosterone from the urine of normal women.[J]. Biochemical Journal, 1938, 32(10):1 759～1 762.

[2] Arima K, Nagasawa M, Bae M. Microbial transformation of Sterols.Part I. Decom- position of cholesterol by Microorganisms[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1969, 33(11): 1 636～1 643.

[3] Nagasawa M, Bae M, Tamura G, et al. Microbial Transformation of Sterols. Part II. Cleavage of Sterol Side Chains by Microorganisms [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1969, 33(11): 1 644～1 650.

[4] Nagasawa M; Watanabe N; Hashiba H. Microbial transformation of Sterols. Part III. Substrate specificity for cleaving steroid side chains by Arthrobacter simplex [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1970, 34(5): 798～800.

[5] Femanders P; Cruz A; Pinheiro H M. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments [J]. Enzyme Microb Technol, 2003, 32(6): 688～705.

[6] Redpath J, Zeelen F J. Stereoselective synthesis of steroid side-chains [J]. Chemical Society Reviews, 1983, 12(1): 75～98.

[7] Hogg J A. Steroids, the steroid community, and Upjohn in perspective: a profile of innovation [J]. Steroids. 1992, 57(12): 593～616.

[8] 王红霞, 叶景泉, 姜中兴. 螺内酯的合成[J]. 中国医药工业杂志, 2005, 36(1): 1～3.

[9] Gioiello A, Sardella R, Rosatelli E., et al. Novel stereoselective synthesis and chromatographic evaluation of E-guggulsterone[J]. Steroids, 2012, 77(3): 250～254.

[10] Nussbaum A L, Yuan E, Dincer D., et al. Enol Ethers of Steroidal Δ4-3-Ketones[J]. The Journal of Organic Chemistry, 1961, 26(10): 3 925～3 928.