基于光干涉技术的叶片表面微结构特征获取与表征

李青林， 王锦涛

(江苏大学现代农业装备与技术教育部重点实验室，江苏镇江 212013)

叶片作为植物的营养器官，其细胞的结构变化一直被认为是作物生理状态变化的重要指标[1-2]。近年来，研究人员开始关注植物叶片表面微结构与作物生理状态之间关系的研究，并取得了很大进展。Franks等研究了不同养分条件下叶片表面结构的变化[3-7]；Kalicharan等研究了香茶菜表面绒毛的分布、形态及其随时间的化学特征的变化[8]。

现有表面微结构的测量方法主要有扫描电镜方法、原子力显微镜方法。扫描电镜方法在植物叶片表面形貌观察方面的应用最为广泛，能得到分辨率高的表面形貌图，但是需要对样本进行复杂的前处理，用时较长，而且对结构参数的度量需要借助别的软件才能完成；原子力显微镜方法是借助探针对被测量表面进行接触测量，因为植物叶片表面是由细胞组成的，极易被损坏，所以该方法不适于叶片表面的测量。因此，研究人员进行了用于植物表面快速测量方法的探索。

Kim等借助白光干涉技术对松树叶表面进行了观察，并进行了叶片表面轮廓的定量表征[9]；Kim等利用白光干涉技术对红楠树叶表面的研究发现，叶片表面分布着颗粒状、角状突起物[10]；张艳借助白光干涉方法研究了透明膜表面三维轮廓变化情况，可以得到表面的三维轮廓，并同时测量出透明薄膜的三维形态信息和厚度[11]。

本研究旨在借助白光干涉方法，获取植物叶片表面几何特征，并根据其几何形态特征选择合适的参数对其进行表征。

1 测量原理

光干涉测量是一种利用光干涉原理测量光程差，从而测定被测对象表面微结构的方法[12]。如图1所示，光源发出的光经分光镜后分成2束，其中1束为参考光线，另1束经被测表面反射。根据2束光线的光程差，从而得到被测表面的结构，并可以进行测量表达。

2 微结构特征获取方法

由于植物组织具有较柔软的特殊性，不能保证和金属样本一样紧贴在载物台表面，因此本研究中采用载玻片的方法，将叶片样本放在载玻片上之后，置于载物台上(图2)。从固定液中取出植物叶片样本后，立刻置于25.4 mm×76.2 mm的载玻片上，叶片正面朝下，背面朝上，并使叶片紧贴载玻片，以保证叶肉样本处于水平状态。

调整物镜和载物台之间的距离(Z向，即垂直方向)使图像聚焦，根据测量对象的不同，选择合适的采集范围。因为叶片表面绒毛高度远远大于气孔、叶肉细胞以及维管束的高度，所以在观察时，需要调整镜头Z向的距离。观察气孔、叶肉细胞以及维管束时，采集的高度最高为20 μm，用精细采集模式进行采集；需要观察绒毛时，重新进行聚焦成像，此时设置采集的高度最高为200 μm，用精细采集模式进行采集。

在显微系统下观察叶片表面气孔、叶肉细胞、维管束和绒毛的几何特征，分别进行二维、三维成像，选取典型视野拍照。每个样本至少观察统计10个视野，取平均值。本研究中所有的测量数据均由测量系统自带软件测量并计算完成。

3 结果与分析

3.1 气孔的形态参数

气孔是由保卫细胞之间形成的凸透镜状的小孔，与其下细胞间隙(气室)相连，在呼吸、蒸腾作用中，是空气和水蒸气的通路，具有重要的生理意义。叶片表面的气孔数量和形态直接影响作物的生理状态，因此需要表征气孔的形态参数，从而确定它们对作物生理状态的影响。图3为叶片表面的气孔分布情况。

为了满足气孔形态参数能表达作物生理状态的要求，本研究选择气孔分布密度、气孔的形态参数作为特征参数。用计数方法计量单位面积内气孔的数量；用几何测量方法来测量气孔的大小；用高度测量、剖面测量和面积测量方法来综合表征气孔的形态特征，在叶肉大小为20 μm×20 μm的条件下，气孔测量结果如下：气孔直径(15.23±3.35) μm，气孔体积(33 889±249)μm3，气孔表面积(3 778.033±80.748)μm2，气孔密度(1 310.75±23.47)个/mm2。

3.2 叶肉表皮细胞的形态参数

叶肉表皮细胞是叶片表面分布最丰富的细胞，由图4可以看出，叶肉表皮细胞结构也呈现出一定的凸凹状，虽然生长状态下表皮细胞呈充盈状态，但当作物受到某种方式的胁迫时，表皮细胞形态会发生变化，所以需要评价叶肉表皮细胞的形态。植物表皮细胞一般按一定的方式紧密排列在一起，从而组成叶片表皮，且细胞形态相似，因此本研究对指定 20 μm×20 μm 区域叶肉表皮细胞的体积、表面积以及细胞数进行测量，相应的叶肉表皮细胞形态参数如下：体积(33 889±249)μm3，表面积(3 778.033±80.748)μm2，细胞数(53.1±2.7)个。

3.3 维管束的形态参数

叶片表面分布着丰富的维管束，维管束相互连接构成微管系统，输导来自根部的水分、无机盐和养分[13-14]，因此其密度、形态对作物的生理状态有一定的指针作用。图5是维管束分布示意，可见叶片表面维管束分布具有一定的规律性，但维管束直径因其分布位置的不同而存在较大差异，为了充分表达维管束分布和几何形态，本研究选择几何测量、剖面测量和体积测量的方法来表征维管束的形态参数，在叶面积200 μm×200 μm 的条件下，维管束各参数如下：直径(36.23±4.65)μm，面积占叶面积40.3%，总体积(262 219±2 345)μm3。

3.4 绒毛的形态参数

叶片表面分布着绒毛，最新的研究表明，绒毛在作物的代谢方面有着重要的作用，从而影响作物的生理过程。为了实现用绒毛参数充分反映作物的生理状态，本研究重点分析绒毛分布和绒毛形态。从图6可以看出，绒毛高度远远大于周围其他组织，因此用绒毛密度、高度和体积参数来表征其形态，在叶面积40 μm×40 μm的条件下，绒毛各参数如下：绒毛高度(195.245±10.245)μm，单根绒毛体积(202 772±574)μm3，绒毛密度(21.87±2.50)根/mm2。

4 讨论

光干涉技术可以快速获得叶片表面微结构形态，无须对样本进行复杂的前处理。用该方法得到的图片能反映叶片表面微结构，并且能在测量系统自带软件中实现微结构形态参数的测量。

根据叶片表面微结构并结合作物的生理代谢过程，本研究选择了叶片表面气孔分布和形态、维管束分布和直径、叶肉表皮细胞形态、绒毛分布密度、绒毛高度和体积作为叶片表面微结构特征的表征参数，从而为基于叶片表面微结构进行作物生长信息模型的建立提供了依据。

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