GERD食管上皮组织紧密连接蛋白和氧化应激在发病中的研究进展

曹正一 买买提·依斯热依力 克力木·阿不都热依木

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是指胃十二指肠内容物反流入食管及以上消化道所致的症状和并发症的一种慢性消化系统疾病，包括非糜烂性食管炎（non-erosive reflux disease，NERD）、糜烂性食管炎（erosiveesophagitis，EE）、Barrett食管（Barrett'sesophagus，BE）和消化性食管狭窄（stenosis of the esophagus，SE），烧心和反流是GERD的常见的典型症状［1］。此外，患者还经常出现GERD所致非心源性胸痛、慢性哮喘、慢性咽炎及心房颤动等食管外症状，因患者长期受上述症状的影响，无论是生活质量还是经济压力，都给他们带来了很大的负面影响［2］。虽然我国还没有明确的流行病学资料可供明确说明GERD在我国整体的准确发病率，但近10年来陆续有不同地域研究报道其发病率为2.30%～16.98%［3］。北京、上海2地调查显示GERD患病率为5.77%［4］，我国新疆地区GERD的发病率较高，接近GERD发病率较高的部分西方国家。GERD的诊治在消化学科领域仍存在一定的争议：（1）其诊断方法有很多，目前临床上一般是通过多种诊断方法寻求证据互相支持，综合评估后再予以最终诊断。GERD诊断常用的方法主要有：采用GERD问卷调查了解患者相关症状的频率和严重程度来初步诊断，上消化道内镜检查，质子泵抑制剂（proton pump inhibitors，PPIs）试验性治疗，食管24 h pH监测。而目前对于诊断GERD仍缺乏真正意义上的“金标准”，依旧依靠的是多项辅助检查综合评估后予以临床诊断。（2）因GERD病因较多，发病的过程较为复杂，整体发病机制尚未完全清楚，所以其治疗的效果也无法使患者满意，即治疗效果无法大面积覆盖及保证质量［1-3］。虽然目前临床抑酸治疗是治理GERD的最佳途径，但仍有一部分的患者对其疗效欠佳。因此，寻求一种客观证据来证明该病发生发展的过程，进而以该客观证据为突破口，寻求新的治疗GERD的方法和为新药的开发提供有力的证据支持，显得尤为重要。

一、GERD发病机制

临床及基础研究显示，抗反流屏障功能障碍在GERD的发生发展中起举足轻重的作用。GERD的发生发展可能与食管防御功能（抗反流屏障、食管酸清除、黏膜抵抗力）、侵袭因素（胃酸pH值、酸分泌量、十二指肠内容物反流）的平衡被打破有关［5］。最近的研究更是直接提供了有力的证据，胃酸侵蚀食管黏膜引起的化学性损伤，直接导致食管黏膜屏障功能受损，这也从直观的视角利用微观的角度证明食管粘膜屏障功能受损是GERD发生的重要“标志”［6］。有学者提出，紧密连接（tight junction，TJ）蛋白可能成为GERD食管微观形态结构异常的客观指标［7］。食管上皮细胞屏障功能损伤与TJ复合物的解离或缺失有关。谭佳成等［8］研究发现，GERD患者食管上皮TJ蛋白表达和分布异常可导致上皮细胞间隙增宽（dilated intercellular space，DIS）。Weijenborg 等［9］研究发现，DIS做为黏膜完整性受损的形态学特征，促进了胃酸在黏膜下层的渗透，而渗透至黏膜下层的酸使得GERD患者酸敏感性逐渐增高。另外一项临床研究也发现，食管上皮DIS直径扩大与GERD患者烧心症状直接显著相关［10］。Woodland等［11］研究显示，胃镜下NERD患者食管黏膜组织虽然未见宏观的糜烂性改变，但食管黏膜完整性的细微缺陷可能导致患者反流的感觉增强或烧心等症状的加重。Farré等［6］使用胃酸灌注的GERD大鼠模型中发现，胃酸导致食管黏膜通透性增强，使细胞间间隙扩大，从而导致食管黏膜破坏。

上述相关结构蛋白和连接蛋白组成了复杂的蛋白连接体系，稳定的食管连接蛋白体系各个结构共同维持食管黏膜屏障的完整性，一旦该平衡体系被打破，将引起相关组织结构的形态学变化，进而产生食管生理结构损伤或临床症状。基于组织基本结构和病理学理论，即DIS将诱导胃酸或胆汁等胃内容物反流到增宽的细胞间隙中，从而诱导黏膜本身趋化因子和细胞因子的释放，产生炎症反应，最终引起食管上皮屏障功能障碍［12］。

二、TJ蛋白在GERD发生中的作用

食管黏膜与反流的食物反复长期接触，是食管抗反流屏障功能受损和腔隙反流物清除障碍所导致的。食管抗反流屏障功能障碍主要表现为下食管括约肌松弛和食管黏膜防御能力下降等。食管黏膜防御功能以上皮屏障来完成的，食管上皮屏障主要由上皮细胞膜和TJ蛋白构成［13］。TJ蛋白是细胞与细胞之间相互连接的一个至关重要的结构，是由一系列跨膜蛋白与外周蛋白相互作用形成的复杂蛋白质体系，该体系受多种信号通路的协同调节。同时TJ蛋白是构成食管黏膜机械屏障最重要的结构，由咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudin）、胞质紧密黏连蛋白（zonula occludens，ZOs）及连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）等结构蛋白和各类连接蛋白共同组成。

1.咬合蛋白（Occludin）：Occludin是TJ重要的结构和功能组成部分。Occludin属于进化上具有保守功能的一种重要基因。在人体中，Occludin蛋白的基因定位于5q13。cDNA和氨基酸序列分析研究表明，小鼠、人类和狗Occludin基因有90%的同源性［14］。Occludin蛋白是一个相对分子质量为65 000的跨膜蛋白，它含有4个疏水跨膜结构域，把蛋白分成5个部分：2个细胞外环，位于细胞质区的N末端和C末端以及1个细胞内环。第1个细胞外环对细胞间的黏合具有重要作用；第2细胞外环使Occludin稳定地组装进TJ；N末端和C末端对维持TJ的屏障功能具有重要作用，并且C末端可与ZO-1蛋白结合维持TJ的完整性。Occludin的主要生物学功能为栅栏功能和屏障调节功能。栅栏功能把上皮细胞质膜分成顶侧的脂质部分和基侧的蛋白部分，可以阻止2个不同功能区之间的相互弥散，有助于细胞极性的形成［15］。屏障调节功能则对分子大小、离子类型、细胞渗透性等有选择性，可以调节细胞问小分子的运输，维持组织稳态。Occludin的磷酸化调控机制错综复杂，目前普遍认为，其磷酸化结合位点主要落在丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸残基上。蛋白激酶（protein kinase，PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）调节Occludin丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的磷酸化和去磷酸化，从而调节TJ结构的整合与分解。在完整的上皮组织中，Occludin蛋白的丝氨酸／苏氨酸高度磷酸化［16-17］。研究表明，丝氨酸/苏氨酸磷酸化可能促进Occludin整合进TJ结构，从而提高TJ的完整性。实验研究证明，各种因素导致的TJ的破坏都伴有Occludin酪氨酸的磷酸化有关，Occludin酪氨酸的磷酸化能减弱其与ZO-1的相互作用，从而引起TJ的断裂［16］。

2.闭合蛋白（Claudin）：动物TJ蛋白中存在两种不同于Occludin的蛋白，分别由211个和230个氨基酸构成。经过亲水性的分析研究显示他们均有4个跨膜区，并分别命名为Claudin-1和Claudin-1-2。目前已发现的Claudins家族由24个跨膜蛋白亚型组成。每一个Claudin分子均由4个跨膜结构域组成，氨基和羧基末端都在细胞内，羧基末端富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。Claudins具有2个长度不相等的细胞外环系统，在不同Claudins分子之间，第1和4个跨膜片段及细胞外环的氨基酸序列具有高度保守性［16，18］。Claudins直接作用于紧密连接膜相关蛋白的鸟苷酸激酶同工酶、ZO-1、ZO-2、ZO-3及富含PDZ结构域的蛋白来维持紧密连接特有的栅栏以及屏障功能。多种信号分子参与紧密连接蛋白的调节，如Rho因子、Ca2＋、蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、异三聚体G蛋白等［18］。这些分子具有两个共同的作用靶位点：肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白与肌动蛋白相连并定位于从底部到顶点的连接复合物，肌球蛋白结构收缩可有对紧密连接膜产生离心性的牵引、进而调节紧密连接的渗透性。Claudins对细胞连接处渗透性的调节主要通过蛋白激酶途径实现，蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）或PKC的活化直接作用于Claudins上特定氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）靶点［15］。Claudins磷酸化后，紧密连接功能下降，表现为氯化物渗透性增加，可能原因是磷酸化的Claudins干扰紧密连接的形成，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。不同蛋白激酶作用于不同的Claudin蛋白。Claudin蛋白的表达异常可直接影响整个紧密连接蛋白系统的结构和功能。这种改变可以是Claudins数量上的改变，也可能是基因上的突变［17-18］。一旦紧密连接功能下降，上皮细胞的极性遭到破坏，不同液性的脂质或完整蛋白可自由扩散，上皮细胞两个不同环境之间的渗透屏障同样被受到影响，最终可直接导致其生物学特性的改变，甚至潜在的有害物质或病原体进入机体。

3.胞质紧密黏连蛋白（zonula occludens，ZOs）：ZOs是紧密连接的结构性蛋白，位于细胞质内膜表面，与绝大多数TJ蛋白及细胞骨架相连。ZO蛋白属于膜相关鸟氨酸激酶家族，有3个异构体，即ZO-l、ZO-2和ZO-3，其中ZO-l相对分子质量最大［19］。ZOs蛋白结构相似，具有特殊的亮氨酸锌指样结构。ZO-1在上皮细胞主要定位于紧密连接到肌动蛋白细胞骨架，而非上皮细胞没有紧密连接［15］。ZO-1定位于黏附连接上，通过B链和d链间接地将钙黏附蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架，ZO-1氨基端直接结合到闭锁蛋白羧基端，且ZO-1也与细胞内骨架蛋白如肌动蛋白结合，它把闭锁蛋白和细胞内骨架蛋白紧密连接起来，这表明ZO-1在紧密连接与细胞内相连中起着桥梁作用。研究发现，ZO-1表达水平升高到正常值的3倍时，ZO-l以线型形式定位于上皮细胞，这时闭锁蛋白不连续地存在于紧密连接，表明ZO-1对紧密连接的定位发挥重要的作用［20］。

4.连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）：JAMs是位于极性上皮细胞和内皮细胞间紧密连接处的一种蛋白，属于免疫球蛋白超家族，由2条细胞外Ig样结构域、1个I型跨膜蛋白区、1个在羧基端具有Ⅱ型PDZ结构域的胞质尾区共同组成［16］。其在正常组织结构维持也起着不可忽视的作用。研究表明，JAMs在毗邻的细胞间发挥着连接作用。该蛋白集中在上皮和内皮紧密连接处，对侧细胞膜也具有一定的定位作用［17］。JAMs也与细胞极性复合物的某些成员相互作用，因此参与细胞极性的建立。由非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）在丝氨酸285上的JAM-A磷酸化与排他紧密连接定位，在该位点磷酸化是形成功能性紧束缚中所必需的。JAMs可能对于调节结结构中并不重要，但在粘附信号传导中起着重要的作用［21］。

三、氧化应激在GERD发病中的作用

近年来的研究显示，氧化应激（oxidative stress，OS）在GERD发生发展中发挥着重要的作用［22］。在正常生理状态下机体可维持氧化/抗氧化水平的平衡，OS可导致机体内的该生理平衡失衡，引起器官或组织中性粒细胞等免疫细胞的炎性浸润，蛋白酶分泌增加，最终产生大量氧化中间产物。OS是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量生成或细胞内抗氧化防御系统受损导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，引起生物膜脂质过氧化，细胞内蛋白及酶变形，进而导致DNA损害，最后导致细胞凋亡，结果引起组织损伤，从而对机体造成损害的病理状态［23］。Oh等［24］研究表明，GERD发病机制由ROS介导的，EE大鼠模型中他们使用亚细亚蒿提取物（artemisia asiatica，DA-9601）发现食管黏膜ROS的产生被抑制，继而有效的控制黏膜炎症发生。核因子NF-E2相关因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2，Nrf-2），以及下游基血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是细胞内抗氧化防御机制中的重要蛋白，Nrf2/HO-1通路调控解毒酶及抗氧化应激酶的表达［25］。有研究报道，转录因子Nrf-2敲除小鼠可能由于食道和前胃角化过度症导致小鼠营养不良而至死亡，说明Nrf-2的活性影响了几种鳞状上皮基因的表达水平［26］。Chen等［25］研究了Nrf2在野生型和敲除小鼠食管屏障功能中的作用，发现Nrf2缺乏明显减少跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）而无回流，提示在生理条件下Nrf2的基线保护作用，当食管暴露于反流物4周后，野生型小鼠的食管上皮基底层观察到DIS，Nrf2缺乏加重了Nrf2敲除小鼠食管上皮超微结构的改变，这在胃食管反流的情况下尤为明显。由于Nrf2缺乏导致对应激和氧化还原酶活性下降，他们研究了8-OHDG（一种氧化性DNA损伤标记物）在食管上皮中具有免疫染色，结果发现，与野生型相比，Nrf2敲除小鼠食管上皮细胞中的8-OHDG显著增加，食管上皮细胞间间隙显著增加，并且电子致密物质显著减少。另一项动物实验研究亦发现，GERD小鼠模型中，Nrf2同样也具有保护氧化损伤的作用，特别是在胃或混合返流的情况下，Nrf2缺乏进一步减少了被回流抑制的TEER［27］。这与他们之前的工作相呼应，提示胃食管反流产生ROS，其最终诱导食管DIS，并使得食管上皮屏障功能异常。多项研究显示，OS是许多病理过程中的重要环节，氧自由基参与RE中黏膜中的生理反应活动，在氧化应激持续作用下可能会并发Barrett食管［22-23，28］。可见，氧化/抗氧化防御系统的平衡紊乱在维持食管黏膜稳态/屏障中起关键作用。

四、小结

综上，GERD患者的食管上皮存在TJ结构和功能的异常（细胞旁通透性增加，进而出现DIS）及ROS的过量产生，可能是GERD发生发展中的重要机制之一。但目前，临床研究当中食管黏膜ROS的产生与DIS的直接关系上的机制有待进一步研究。但一旦证明其科学性，那么为新药的研发以及GERD的诊治提供新的理论依据都是具有重大意义的，对于那些抑酸药物等治疗方法治疗后效果欠佳的患者更将是大大的福音。