皮瓣缺血再灌注损伤相关细胞信号通路总结

吴玉伟，金培生

（1徐州医科大学研究生院，江苏 徐州 221004 ；2徐州医科大学附属医院整形外科，江苏 徐州 221002）

目前主要认为缺血再灌注损伤（IR）的机制有以下几个方面：活性氧损伤、炎症反应、钙超载、能量代谢障碍、细胞凋亡、血液循环障碍等。IR是多因素综合作用的病理生理过程，涉及多种分子机制调控，如何防治皮瓣IR是整形外科的重要课题。目前，涉及皮瓣缺血再灌注损伤过程相关的细胞信号转导通路的研究不断的深入，但对其相关研究进展的总结、分析较少。运用计算机检索万方数据库及Pubmed数据库，中文关键词为“皮瓣缺血再灌注损伤，信号通路，凋亡，氧化应激，炎症反应，微循环，钙超载”，英文关键词为“ischemia and reperfusion of skin flap，signal pathway，apoptosis，oxidative stress，inf l ammatory reaction，microcirculation，calcium overload”，查阅纳入文献包括基础、临床研究及综述，进行资料初审，排除重复、陈旧性文献，保留经典文献，选择2005年至2017年间有代表意义文献，纳入35篇符合标准的文献。最终选择36篇文献对皮瓣缺血再灌注损伤过程中相关的细胞信号通路进行阐述并总结、分析。

1 活性氧损伤相关信号通路

皮瓣缺血再灌注过程可产生的大量活性氧（ROS）， ROS产生的有害因子与机体抗氧化防御系统的消耗共同导致细胞功能障碍代谢及活性、细胞膜、蛋白质和DNA等的改变，导致氧化与抗氧化间失衡，最终使细胞死亡。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族由5种亚 类：ERK1/2、JNK、p38、ERK3/4、ERK5组成，ROS激活的MAPKs信号通路主要包括p38、JNK1、JNK2基因表达增加，p‐ERK1、ERK2、p‐ERK2蛋白表达增加。P38 MAPK信号通路主要介导调控细胞内的炎症反应、氧化应激反应过程、凋亡等多种细胞反应[1]，有动物实验表明，抑制P38 MAPK后大鼠皮瓣组织中ROS、丙二醛（MDA）、高级氧化产物（AOPP）[2]、8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHdG）量均下降[3]。抑制P38 MAPK可增加一些氧化还原敏感型基因如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因的表达，使细胞产生预适应，对氧化应激抵抗力增强，从而减轻皮瓣IR。

硫氧还蛋白（Trx）是与SOD系统同样重要的调节细胞内氧化还原平衡的抗氧化系统[4-5]。Trx‐1可有效地清除ROS，发挥抗氧化的生理功能。Das K C，Kundumanisridharan等人发现Trx能够通过MKK4‐NF‐κB 途径上调 SOD 的表达[6]，而0过表达能够增强Trx系统的抑制氧化应激损伤功能[7]，因而SOD系统和Trx系统在抗氧化和清除ROS机制上协同，预防性给予rhTrx‐1可进入组织细胞内发挥抗氧化作用，缓解氧化还原失衡，Trx可作为预防和治疗皮瓣IR的潜在的靶点。

Nrf2/Keap1‐ARE是目前最重要的抗氧化应激内源性通路。核因子E2相关因子2（Nrf2）可诱导依赖性抗氧化反应元件（ARE）启动表达多种抗氧化酶类基因，正常生理状态下Nrf2为低水平转录活性，在发生氧化应激、创伤时可诱导 Nrf2转位入核内激活启动下游多种抗氧化、抗炎等相关靶基因的转录。研究表明过氧化物酶体增殖激活受体（PPARγ）参与氧化应激反应，经配体激活后的PPARγ有较强的抗氧化活性，增强细胞抗氧化能力，从而抑制或减轻细胞凋亡，PPARγ还可与Nrf2、FOXO、Wnt/β‐catenin等信号通路有联系，Nrf2的表达可能是通过PPARγ其上游而被激活，Nrf2和PPARγ之间形成正反馈的环路[8]。蛋白激酶（PKC）信号通路在体内、外氧化应激条件下可通过直接磷酸化而激活Nrf2，磷酸化后的Nrf2，促进 Nrf2转位于胞核内并促使反式激活ARE。机体受到高水平ROS刺激时下游抗氧化酶表达水平的变化可能与MAPKs信号通路的激活相关，MAPKs可直接磷酸化Nrf2，激活 Nrf2 促进ARE的活化，而MAPKs、Nrf2信号通路在参与调控炎症[9]、凋亡[10]、氧化应激[11]等方面发挥重要作用。磷脂酰肌-3-激酶（PI3K）/不典型蛋白激酶C（aPKC）信号通路参与激活Nrf2和调节抗氧化基因，该通路激活Nrf2，引起Nrf2核转位上调谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA和蛋白质的表达提高其活性增加谷胱甘肽合成对抗氧化应激，而起到维持氧化与抗氧化平衡的作用。

FOXO属于叉头转录因子亚家族成员[12]，可调控细胞凋亡、糖类代谢、应激反应抵抗等不同环境条件下细胞的反应进程[13]。FOXO在氧化应激反应过程中可诱导锰型超氧化物歧化酶（MnSOD）基因表达及调节过氧化氢酶（CAT）的表达，此外，FOXO信号途径可减少线粒体ROS的产生，通过cAMP‐PKA‐CREB‐PGC1α 通路促进线粒体增殖，起到保护线粒体结构和功能的作用[14]。

2 炎症反应相关信号通路

皮瓣IR过程会激活炎症反应过程、促进炎症因子的释放、表达，譬如核蛋白因子κB（NF‐κB）、白细胞介素 ‐6（IL‐6）、肿瘤坏死因子 ‐α（TNF‐α）的表达[15]，它们是缺血再灌注损伤过程中炎症反应的重要介质。

P38 MAPK信号通路下游重要的转录因子NF‐κB是炎症反应的关键信号传导因子在炎症反应中起重要作用，通过信号通路的级联激活而增加NF‐κB的表达，促进其转位进入细胞核内，进而启动表达多种炎症介质[16-17]。NF‐κB 还可诱导趋化因子、粘附分子‐1(ICAM‐1) 、血管细胞黏附分子‐1(VCAM‐1)、炎性酶等基因表达使炎性反应级联放大。TNF‐α启动子中有κB的结合位点，NF‐κB活化后转位入核，与多种目的基因序列结合，启动激活炎性因子基因的转录。活化的TNF‐α、IL‐1可促使表达NF‐κB，这样靶细胞因子TNF‐α、IL‐1 与NF‐κB之间形成正反馈的环路。研究表明，同属MAPK家族的p38、ERK、INK三者协同作用增加TNF‐a基因表达，TNF‐α 可通过引起IFN‐γI、L‐10等释放，JAK/STAT通路被激活后，细胞表达高迁移率族蛋白‐1（HMGB1），产生 HMGB1 又促使释放TNF‐a，不断地放大炎症效应，最终导致细胞、组织广泛损害。应用NF‐κB 活化抑制剂和抑制JAK‐STAT、P38 MAPK通路可减轻炎症反应。TLRs（Toll样受体家族）是广泛分布在免疫细胞表面的一类模式识别受体，现被认为是缺血诱导性炎症主要的因素。Toll4/NF‐κB 信号通路中 TLR4/髓样分化蛋白88（MyD88）依赖性途径是激活胞内NF‐κB 主要信号通路[18-19]，受体与配体结合后再结合连接蛋白MyD88，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子‐6(TRAF6)，TRAF‐6活化后使IRAK、IRAK‐2连接于NF‐κB 诱导激酶 (NIK)，从而激活NIK使得α、β激酶进一步活化，IκB丝氨酸位点以磷酸化方式导致IκB发生泛素化而降解，NF‐κB与IκB结合的抑制状态被解除，NF‐κB 激活转位入核内，启动激活细胞因子（TNF‐α、IL‐1、IL‐6、IL‐8、IL‐12）、黏附分子（CD80、CD86）等基因的转录，引起级联反应，产生炎性细胞因子，而这些因子又可反馈性激活TLR4，从而导致损伤进一步加重。TLR4信号通路激活NF‐κB，增强炎性细胞因子表达，促使中性粒细胞浸润并到组织聚集，导致组织器官发生I/R，可通过调控TLR4信号通路中间重要环节减轻皮瓣IR炎症。

PHD-HIF分子通路中氧敏感脯氨酰羟化酶(PHD)是广泛存在于组织细胞质中的基础酶类，其可在有氧环境中羟化合成核因子NF‐κB的关键酶IKKβ而致其失活，使NF‐κB的合成、入核减少，从而抑制NF‐κB相关炎性细胞因子的表达。缺氧诱导转录因子(HIF)是炎性因子中重要的一种，NF‐κB 在核内大量聚集，导致组织细胞HIF蛋白的表达明显增加，同时促进中性粒细胞、内皮细胞合成炎性介质（表达IL‐1、IL‐6、TNF‐α、IFN‐γ等）和趋化因子，从而介导组织细胞的炎症损伤和坏死[20]。

3 细胞凋亡相关信号通路

皮瓣IR后细胞死亡的重要方式为细胞凋亡。P38 MAPK信号通路与凋亡密切相关，陈拓等[21]发现P38蛋白激酶抑制剂SB202190干预组中大鼠皮瓣组织中Bcl‐2的mRNA表达量、蛋白表达量均显著高于模型组，Bax、半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase 3）的mRNA表达量、蛋白表达量均显著低于模型组，这说明抑制P38 MAPK能够抑制移植皮瓣IR过程中的细胞凋亡。

水蛭素可有效的提高淤血皮瓣的成活率，凝血酶与蛋白酶激活受体（PARs）的结合由于天然水蛭素与凝血酶竞争性结合而抑制，从而阻断PARs/p38 MAPK/IKK/NF‐κB 信号通路，使得 Bax 的表达抑制，下调Caspase3活化水平以及Bax/Bcl‐2 比值，从而起到了抗细胞凋亡作用[22]。

Trx‐1是多条细胞凋亡通路的关键调节因子。在胞质中还原型Trx‐1与凋亡信号调节激酶1（ASK1）直接结合，抑制其磷酸化激活，从而抑制ASKMAPK途径相关的细胞凋亡和炎症反应过程，同时Trx‐1可使caspase 3稳定性增强，防止caspase 3被剪切而被激活，从而抗细胞凋亡。Trx‐1 作为皮瓣IR损伤的药物干预靶点具有治疗价值和临床应用前景。

细胞信号上游调节因子ROS 可激活其下游氧化还原状态敏感性ASK1等不同信号分子，进而激活其效应分子MAPK。ASK1激活后可通过MKK4/MKK7激活应激活化激酶（JNK）从而参与组织器官的缺血再灌注损伤。JNK 可通过多种途径诱导细胞凋亡，一方面可通过激活特定的转录因子上调促凋亡基因的表达；另一方面，通过影响Bcl‐2家族蛋白的功能调控细胞凋亡。应用JNK特异性抑制剂SP600125抑制c‐Jun 氨基末端激酶信号通路可减轻大鼠缺血/再灌注模型皮瓣细胞凋亡，Bai等[23]在大鼠腹部皮肤缺血/再灌注模型应用SP600125 后，发现SP组皮瓣存活面积大，血流灌注多，caspase‐3 活性降低 ,pAsk1 和 pJNK的低表达和Bcl‐2高表达水平,Bax显著下降,提示皮瓣细胞凋亡受到了抑制。

PI3K/Akt信号通路具有细胞内源性保护作用，是重要的抗凋亡通路之一。激活PI3K/Akt信号通路对皮瓣IR具有保护作用，Akt可正调节转录因子NF‐κB、Bcl‐2，Bcl‐2是PI3k/Akt下游凋亡蛋白，磷酸化Akt可抑制Bad的凋亡作用，同时也可促进Bcl‐2的抗凋亡作用，Akt通过对凋亡、抗凋亡基因表达的影响，并且通过Bad 直接磷酸化，维持细胞的生存。

4 微循环相关信号通路

血管内皮细胞和血管平滑肌是血液微循环的基础，微循环障碍是皮瓣IR损伤的重要机制。糖尿病缺血皮瓣模型通过移植脂肪干细胞(ASCs)，发现可激活HIF‐1α/VEGF通路，增强VEGF蛋白表达，促进新血管形成，通过改善缺血皮瓣的微循环血流灌注保护皮瓣[24]。局部移植 ASCs可促进创面愈合、皮瓣成活，而ASCs参与组织再生主要通过分泌血管生成因子（VEGF等）和调节内源性血管形成、血管生成[25-26]。Song 等发现Akt/c‐myc 通路可能与介导ASCs分泌VEGF相关[27]。内皮细胞Akt的激活，可增加生成NO起到维持内皮细胞功能层的作用，从而减轻血管损伤。因此，在皮瓣IR缺血、炎症、氧化应激的环境中移植入 ASCs分泌表达相应生长因子，发挥保护皮瓣的作用。Xu等[28]发现丹参酮IIA（TSA）预处理后，皮瓣组织中Wnt信号通路、干细胞相关生物标志物、血管内皮生长因子、CD34的表达等均参与了血管再生，TSA预处理通过激活Wnt信号和上调干细胞相关标志物保护游离皮瓣缺氧损伤。

水蛭素可通过p38 MAPK/IKK/NF‐κB 信号通路影响术后血运障碍皮瓣中IL‐6、TNFα、ICAM‐1 的表达，ICAM‐1具有稳定细胞间作用和促进内皮细胞和白血球迁移的作用[29]，ICAM‐1表达过度增加，可导致白细胞与内皮细胞黏附的瀑布反应，造成白细胞聚集并释放炎症介质、组织溶解酶，使细胞损伤加重，TNF‐α在这一调节网络中具有重要作用，Min 等[30]证实，被TNFα激活的细胞因子可作为炎性介质加强内皮与白细胞间的作用，上调内皮细胞表达ICAM‐1 与VCAM‐1，通过PLC、蛋白激酶C (PKC)、PI3K、ROS等产生级联反应，还能使NF‐κB激活启动内皮细胞的炎性反应，从而引起血管损伤。

氧化应激损伤内皮功能，内皮细胞细胞高表达粘附分子和整合素，内皮与中性粒细胞、单核细胞粘附加强，改变血液的有形成分促使形成血栓，PI3K‐Akt‐eNOS‐NO‐NF‐κB、PKC‐ERKs信 号传导通路与此过程有关。细胞应激反应、内皮、血管紧张素Ⅱ可引起氧化应激反应刺激血管平滑肌细胞的增生、迁移、凋亡。缺血再灌注损伤的脂质过氧化作用、蛋白质氧化、炎症因子与氧化还原蛋白的过表达，共同导致细胞内钙超载、DNA断裂、血栓形成、炎症反应、细胞凋亡、血管重塑等，而这些因素将损伤血管平滑肌细胞及内皮细胞[31]。ARE 可编码Ⅱ型相解毒酶和抗氧化蛋白，而Nrf2可调控多种ARE抗氧化蛋白的表达，在ROS损伤内皮细胞过程起着至关重要的作用，Nrf2/ARE通路作用其靶基因醌氧化还原酶1（NQ‐01）、抗氧化酶血红素加氧酶1（HO‐1）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和硫氧还蛋白（TRX）等保护血管[32]，改善微循环从而减轻皮瓣IR损伤。

5 钙超载相关信号通路

皮瓣组织在长时间缺血再灌注后可产生大量ROS，ROS产生主要部位是线粒体呼吸链，同时线粒体也易受ROS攻击而损伤，大量的ROS干扰核酸复制、呼吸链酶复合物和氧化线粒体蛋白质，使其催化及降解功能丧失；线粒体膜通透性转换孔(MPTP)受ROS诱导而开放，导致线粒体发生肿胀、破裂及释放细胞色素C，使其结构受到破坏，从而导致线粒体功能障碍，能量生成减少，钙泵活性降低，Ca2+泵出减少，使细胞内Ca2+积聚；ROS作用于膜磷脂引起膜脂质过氧化，增加细胞膜对Ca2+的通透性，细胞外Ca2+大量进入细胞内，导致Ca2+浓度增高，一旦钙超载发生，可刺激线粒体、肌质网耗能增加，导致细胞能量供应不足发生酸中毒，Na在细胞集聚激活Na/Ca2+交换系统，又使大量Ca2+进入细胞内，加重钙超载。钙超载可激活Ca2+依赖性中性蛋白酶，介导TNF信号转导通路及调控P53，从而诱发细胞凋亡。目前认为钙超载与细胞凋亡密切相关，细胞钙超载可能是细胞发生凋亡的条件。

PI3K‐Akt信号转导通路的激活可减少Bcl‐2 的下降和caspase‐3 的活化[33-34]，而作为细胞凋亡过程中起重要作用的Bcl‐2蛋白可阻断线粒体上MPTP、减少细胞内钙超载，抑制细胞凋亡[35-36]，Akt活化后可调控线粒体上的MPTP，促使细胞内Ca2+排出，降低细胞内钙浓度。同时MPTP可调控白介素、细胞色素C、凋亡因子释放，最终抑制细胞凋亡。

蛋白激酶C依赖Ca2+、DG和磷脂酰丝氨酸(PS)而激动,参与调节钙稳态，细胞内PKC信号转导途径可被氧自由基、脂质过氧化产物激活，使细胞膜上L型钙通道磷酸化激活Na/Ca2+和Na/H交换及增强钙泵活力，从而维持细胞钙稳态。细胞内钙离子浓度的升高可激活细胞内钙敏信号：PKC、MAPKs、钙/钙调素依赖性蛋白激酶（Ca2+/CaMK）和钙调神经磷酸酶(CaN)等，此外细胞内Ca2+浓度升高可使Fos、Jun、Nru77等转录因子活性改变，启动细胞凋亡。Ca2+螯合剂、钙通道阻滞剂及钙调素拮抗物均可减轻钙超载，减轻细胞凋亡，减轻皮瓣IR。

综上所述，皮瓣缺血再灌注损伤的保护可从其发生、发展的一系列病理生理过程所相关的信号转导通路层面出发，寻求减轻或预防IR方法、措施，但IR是多种细胞信号通路相交叉、相影响的结果，与IR相关的信号通路中仍存有许多疑问，未来对IR相关细胞信号通路进一步深入地研究将成为了解IR发生发展过程，更好的预防和减轻皮瓣缺血再灌注损伤的关键。

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