同型半胱氨酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与缺血性卒中的关系研究

张露，崔晓燕，张博爱，3

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是脑血管病最常见的类型，约占全部脑血管病的三分之二[1]。近年来大量研究表明，血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平增高是缺血性卒中的独立危险因素[2]。Hcy水平增高可受多种因素影响[3]，其代谢的关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）起关键作用，其中以MTHFR基因C667T碱基突变最常见[4]。MTHFR C667T基因突变是否与IS有关，目前国内外研究结果尚不一致。本研究采用酶循环法和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-基因芯片检测IS患者和无缺血性脑血管病对照者血浆Hcy水平及MTHFR C667T基因多态性分型，探讨其与IS的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2014年6月-2016年2月于郑州大学第一附属医院神经内科及神经介入科确诊为IS的住院患者（IS组），选择同期无缺血性脑血管病病史，于医院其他科室住院患者为对照组。

纳入标准：IS组符合：①1995年第4届全国脑血管病学术会议修订的IS诊断标准；②首次卒中，急性期；③经头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和（或）电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查确诊。对照组要求无心脑血管疾病病史。

排除标准：IS组排除有出血转化、心源性脑栓塞者；对照组排除任何脑血管疾病、下肢静脉血栓、冠状动脉粥样硬化性心脏病、重度抑郁者等；两组均排除有恶性肿瘤、器官功能衰竭、肝肾功能异常、甲亢、癫痫等疾病者。

1.2 方法

1.2.1 分组与分析指标 按照以上纳入和排除标准，分为IS组和对照组，比较两组平均年龄和吸烟者、饮酒者、高血压患者、高血脂患者、糖尿病患者比例构成。其中，饮酒定义为近一年每周平均饮酒3次及其以上者；吸烟定义为每日吸烟1支及以上，连续吸烟1年及以上者[5]。分析两组MTHFR C667T基因型、血浆Hcy水平的差异及Hcy与血清VitB12、叶酸水平的相关性。

1.2.2 血浆Hcy水平及血清VitB12、叶酸浓度的检测 所有患者均于清晨空腹采集外周静脉血2 ml于乙二胺四乙酸钠抗凝管中，酶循环法检测血浆Hcy水平，免疫分析法检测血清VitB12和叶酸浓度。

1.2.3 基因型的检测 用PCR-芯片杂交法检测MTHFR C667T基因型多态性，共3种基因型：CC（酶活性高，叶酸转化能力高）、CT（酶活性中，叶酸转化能力中等）、TT（酶活性低，叶酸转化能力低下）（图1）。

图 1 MTHFR C667T 3种基因型

1.2.4 血浆Hcy水平与VitB12及叶酸之间的相关性排除近3个月内服用VitB12、叶酸制剂而影响相关指标者。将IS组与对照组分别进行Hcy与VitB12及叶酸水平的相关性分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计处理。符合正态分布的计量资料采用表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni检验。不符合正态分布的计量资料用中位数和四分位数表示。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。血浆Hcy水平与VitB12及叶酸之间的相关性采用Spearman分析。P＜0.05认为有统计学意义。对基因频率在人群中的分布进行Hardy-Weinberg平衡适合度检验。检验水准取α=0.05，P＞0.05认为基因频率分布差异无显著性。

2 结果

2.1 一般资料 研究共纳入IS组217例，其中短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）患者15例，缺血性卒中患者202例，年龄36～83岁。对照组纳入了223例，年龄40～84岁。IS组平均年龄和吸烟、高血压病、糖尿病的比例均显著高于对照组，两组性别、饮酒者和高脂血症的比例差异无显著性（表1）。

2.2 两组血浆Hcy水平检测结果 IS组血浆Hcy水平为（23.95±12.13）μmol/L，显著高于对照组（17.31±7.20）μmol/L（t=29.61，P＜0.001）。

2.3 Hardy-Weinberg 平衡吻合度检验 IS组（χ2=0.0170，P=0.918）和对照组（χ2=0.000，P=1.000）基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有人群代表性。

2.4MTHFR C667T基因多态性及等位基因频率分布 IS组CC（31例）、CT（97例）、TT（89例）3种基因型分布频率分别为14.3%、44.7%、41.0%，对照组CC（41例）、CT（109例）、TT（73例）3种基因型分布频率分别为18.4%、48.9%、32.7%，两组基因型频率差异无显著性（χ2=3.59，P=0.166）。两组CC+CT与TT基因型分布频率差异无显著性（χ2=3.24，P=0.072）。IS组MTHFR基因C、T等位基因频率分别为36.6%、63.4%，对照组C、T等位基因频率分别为42.8%、57.2%，差异无显著性（χ2=3.52，P=0.061）（表2）。

2.5MTHFR C667T基因型多态性与血浆Hcy浓度的关系 缺血性卒中患者组CC、CT、TT基因型对应的平均血浆Hcy水平分别为（16.65±6.90）μmol/L、（18.21±8.08）μmol/L及（25.19±12.53）μmol/L，差异有显著性（F=490.49，P＜0.001），其中TT基因型Hcy水平明显高于CC及CT基因型，CT基因型显著高于CC基因型（均P＜0.001）。

2.6 血浆Hcy水平与VitB12及叶酸的相关性分析IS组排除最近服用过含VitB12及叶酸的药物后共有88例患者，Hcy、VitB12及叶酸水平分别为15.7（12.9，19.54）μmol/L、280.00（217.00，353.00）pmol/L及4.00（3.00，5.10）ng/L，血浆Hcy水平与VitB12和叶酸水平均呈负相关（rs分别为-0.431和-0.507，P均＜0.001）。对照组中排除最近服用过含VitB12及叶酸的药物后有125例，Hcy、VitB12及叶酸水平分别为15.7（12.9，19.54）μmol/L、320（265.00，447.00）pmol/L、5.4（3.9，7.1）ng/L，血浆Hcy水平与VitB12和叶酸水平均呈负相关（rs分别为-0.489和-0.446，均P＜0.001）。

3 讨论

Hcy是人体内的一种含硫氨基酸，是甲硫氨酸和半胱氨酸代谢的重要中间产物，1969年McCully[6]的研究显示其为心血管疾病的独立危险因素。Ashjazadeh等[7]开展的一个病例对照研究显示，相对正常对照组，矫正传统危险因素后高Hcy血症（血浆Hcy＞15 μmol/L）引起卒中的比值比（odds ratio，OR）为2.17[95%可信区间（confidence interval，CI）1.24～3.79]。本次研究结果中IS组血浆Hcy水平明显高于对照组，差异有显著性，也验证了该结论。

研究显示，Hcy可能通过影响机体凝血、血小板功能、血管平滑肌细胞反应、内皮功能等导致动脉血栓形成[8]。Hofmann[9]研究表明，高Hcy血症可通过增强血管中核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-NB）的活动来调节一系列基因的表达，从而破坏机体自我稳态中抗炎和抗血栓机制。通常情况下，Hcy在体内有4种代谢途径，其中一种是Hcy在甲硫氨酸合成酶的作用下，以VitB12为辅助因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体生成L-甲硫氨酸，参与甲硫氨酸循环，最终分解为丙酮酸、硫酸和水，随尿液排出体外[10]。本研究结果表明，缺血性卒中和无卒中的对照组Hcy水平与VitB12及叶酸均呈负相关，分析其原因可能是体内VitB12和叶酸缺乏导致了甲硫氨酸循环障碍，从而使Hcy在体内蓄积。目前，已有研究证实叶酸能效降低血浆Hcy浓度[11]。Zeng等[12]Meta分析亦表明，补充叶酸对叶酸低摄入地区高Hcy血症的发病有轻度预防作用；而单独补充VitB12降低血浆Hcy水平效果不明显，只有同时补充叶酸才能显著降低血浆Hcy水平。

N5-甲基四氢叶酸在N5-N10-MTHFR的催化下形成，MTHFR基因的突变可降低该酶的活性，引起血浆Hcy水平的增高。流行病学研究显示，MTHFR基因（C667T）T等位基因突变可解释血浆Hcy水平总变异的6%[13]，MTHFR基因多态性被认为是心脑血管疾病危险因素的候选基因[14]。MTHFR基因有多个突变位点，至少有7个位点易发生C→T突变，位于第四位外显子C667T位点突变最为常见。有研究发现，MTHFR C677T杂合子酶活性仅为野生型的30%，可导致纯合子血浆Hcy浓度较杂合子及野生型明显升高[15]。在本研究中，所有患者的TT基因型Hcy平均水平明显高于CC及CT基因型，CT基因型高于CC基因型，差异均具有显著性。故推荐血浆Hcy水平异常增高的患者做MTHFR C667T基因型测定，以指导治疗。

表1 缺血性卒中组与和对照组一般临床资料的比较

表2 MTHFR C667T基因型频率分布

MTHFR C667T基因突变是否是IS的危险因素，目前尚有争议。Konrad等[16]通过配对的病例对照研究认为，MTHFR C667T基因多态性与IS没有关系。马涛[17]亦得出相同结论。然而，Harbuzova等[18]和Li等[19]的研究则认为MTHFR C667T基因多态性是IS的危险因素。本次研究结果显示，CC、CT、TT三种基因型分布频率、C、T等位基因频率在IS组与对照组中的差异不具有显著性，提示MTHFR C667T基因突变可能不是IS的危险因素，分析原因可能为IS的发生是遗传和环境多种因素相互作用的一个复杂过程，与传统的危险因素相比较而言，MTHFR C667T基因的作用可能受到基因与基因的相互作用，转录、翻译过程中的修饰以及蛋白质之间的相互作用的影响。Tasdemir等[20]通过检测599例IS患者和100例正常对照者7种具有促血栓形成危险的候选基因的基因型认为，MTHFR C667T基因突变在IS的发生中不具有重要作用。

综上所述，这次较大样本的病例对照研究结果提示IS患者血浆Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突变、体内叶酸与VitB12水平降低均可使Hcy水平升高，但未发现MTHFR C667T基因突变与IS有关系。本研究属于医院内病例对照研究，可能存在住院选择偏倚。另有研究认为，在基因相关性研究中，尤其是在进行进一步的亚组分析时，要建立可靠的结论，每组需要至少1000例样本量[21]。因此，后续研究仍需进一步大规模多中心的队列研究。

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【点睛】本研究证实了缺血性卒中患者血浆Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突变、叶酸和VitB12水平降低是血浆Hcy水平升高的影响因素，而MTHFR C667T基因突变与缺血性卒中无关。