高脂饮食通过p-AMPK/mTOR信号通路下调小鼠肝细胞自噬水平

徐 玲，马红艳，杨 军，高陈林

(西南医科大学附属医院 内分泌代谢科， 四川 泸州 646000)

研究论文

高脂饮食通过p-AMPK/mTOR信号通路下调小鼠肝细胞自噬水平

徐 玲*，马红艳，杨 军，高陈林

(西南医科大学附属医院 内分泌代谢科， 四川 泸州 646000)

目的探讨高脂饮食对小鼠肝细胞自噬的影响并分析其可能机制。方法将C57BL小鼠随机分为2组，每组n=15，给予常规饮食(NC)或高脂饮食(HFD)喂养，8、12和16周后每组随机处死5只小鼠，测体质量、肝质量、内脏脂肪质量；油红(Oil-Red-O)染色测肝脂质沉积；Western blot检测肝脏自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和自噬调控信号通路蛋白p-mTOR和p-AMPK的表达。结果8周时，HFD组小鼠出现腹型肥胖，16周时小鼠体质量、内脏脂肪质量及肝脂滴沉积较NC组明显增加(P<0.01)；HFD组8周时肝脏LC3Ⅱ表达较NC组增加(P<0.05)；而12及16周肝脏LC3Ⅱ表达较NC组显著降低(P<0.05)；P62表达较NC组明显增加(P<0.05)。与NC组相比，HFD组各时间点肝脏p-AMPK表达均减少，而p-mTOR蛋白表达均显著增加。结论高脂饮食初期小鼠肝细胞自噬短暂增加，但长期高脂饮食可导致肝细胞自噬水平显著下调甚至衰竭，肝细胞自噬水平下调与高脂饮食抑制肝细胞p-AMPK表达及增加p-mTOR的活性有关。

自噬；肝细胞；高脂饮食

自噬(autophagy)是通过细胞内的溶酶体途径，降解和再利用自身衰老和功能异常的细胞器、损坏的蛋白质和脂质等细胞质内成分的过程，是细胞进行自我保护的一种重要机制[1]。研究发现肝细胞自噬与脂肪肝、2 型糖尿病和肥胖等代谢性疾病密切相关[2- 3]。但关于肝细胞自噬与肥胖和脂肪肝等代谢性疾病的相互作用不完全清楚且存在争议。有报道[4]高脂饮食导致肝细胞自噬明显降低；也有报道[5]高脂饮食早期并没有引起肝细胞自噬的改变。就其原因可能与实验模型及观察时间差异有关。

mTOR (mammalian target of rapamycin, mTOR)蛋白是自噬发生的主要抑制蛋白，AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为一种细胞能量敏感因子，参与mTOR信号通路调节细胞自噬[6]。据此，本研究采用不同饮食喂养小鼠，分不同时间点观察高脂饮食对肝细胞自噬以及AMPK/mTOR信号通路的影响，探讨高脂饮食对肥胖小鼠肝细胞自噬的影响和可能作用机制，为今后高脂诱导的肥胖和脂肪肝等代谢性疾病的防治提供新的方向及靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级8周龄体质量为20～23 g的C57BL 雄性小鼠[西南医科大学动物实验室提供，SCXK(川)2013- 17]。

1.1.2 实验材料：总蛋白抽提试剂盒(Chemicon公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)；ECL Plus化学发光试剂盒(Amersham公司)；兔抗小鼠单克隆抗体p-mTOR、p-AMPK(Cell Signal公司)；兔抗小鼠单克隆抗体β-acting、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和油红O(Sigma公司)；兔抗小鼠单克隆抗体P62/SQSTM1(MBL公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：将小鼠分为对照组(control, NC)(16%脂肪)和高脂饮食组(high fat die, HFD)(52%脂肪)，每组15只，自由进食及饮水，每周测体质量及进食量，喂养8、12和16周测体质量后，两组分别随机处死5只小鼠，测内脏脂肪(肠系膜和附睾脂肪组织)和肝脏质量。

1.2.2 Oil-Red-O染色测肝细胞脂质沉积：取肝组织，OCT包埋并冰冻切片(8 μm)，10%甲醛固定，60%异丙醇处理后行油红稀释液染色20 min，70%甘油封片，显微镜观察肝细胞中脂质的沉积。

1.2.3 Western blot检测测肝细胞中p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白的表达：取肝脏组织，裂解液裂解，提取细胞总蛋白，用BCA法测蛋白含量。5%～15 %的SDS-PAGE 电泳,转移至PVDF膜,脱脂牛奶封闭,分别加入兔抗p-mTOR、p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62/SQSTM1、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，再经HRP 标记的二抗室温反应1 h，化学发光显影，Bio-rad紫外凝胶成像分析系统进行吸光度扫描。结果以p-mTOR、p-AMPK、P62与β-actin INT值的比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ INT值的比值进行统计分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠的体质量、内脏脂肪及肝脏质量的比较

各小鼠生长良好，对照组(control)小鼠每天进食热量(10.64±1.15)kcal，高脂组(HFD)小鼠每天进食热量(10.55±1.42)kcal。

8周时高脂饮食组小鼠内脏脂肪显著增加(P<0.01)，16周时高脂组小鼠体质量和内脏脂肪较对照组增加更为明显(P<0.01)(表1)。

2.2 各组小鼠肝细胞脂质沉积的比较

与对照组比较， 高脂饮食喂养8周，小鼠肝细胞已经出现脂质沉积，但脂滴较小，随着高脂饮食喂养时间延长，高脂饮食组小鼠肝泡沫细胞增多，脂质沉积明显增多，脂滴明显增大(图1)。

表1 各组小鼠体质量、内脏脂肪及肝脏质量比较Table 1 Body weight,intra abdominal fat and liver weight of each group of mice(±s,g, n=5)

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各组小鼠肝细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白表达的比较

与对照组相比，高脂组8周时小鼠肝脏LC3Ⅱ表达稍增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.05)。12及16周时，高脂组肝脏LC3Ⅱ表达较对照组明显减少，而P62蛋白明显增加(图2)。

2.4 各组小鼠肝脏p-mTOR、p-AMPK蛋白表达的比较

与对照组相比，HFD组8周时小鼠肝脏p-AMPK表达稍减少，12、16周时p-AMPK蛋白减少更明显，呈时间依赖性。与之相反，高脂组8、12和16周时小鼠肝脏p-mTOR蛋白表达较对照组显著增加(图3)。

3 讨论

自噬广泛存在于真核细胞中，涉及细胞内部结构降解及重复利用，是细胞进行自我保护的一种重要机制。在自噬过程中，微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3, LC3)是自噬体的标志分子，LC3Ⅱ的表达强度及LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值与自噬呈正相关。P62是细胞自噬的经典底物，P62增多表明自噬对细胞内错误折叠或损伤的蛋白降解能力下降或失能。肝细胞自噬功能受损会阻碍肝内脂滴的降解导致肝细胞脂肪沉积。故检测细胞LC3Ⅱ、 P62表达和肝脂滴沉积情况可作为自噬水平的监测[7]。

*P<0.05 compared with control group图2 各组小鼠肝细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白的表达Fig 2 Expression of hepatic LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and P62 protein among groups of mice(±s, n=5)

*P<0.05 compared with control group图3 各组小鼠肝脏p-mTOR、p-AMPK蛋白的表达Fig 3 Expression of hepatic p-mTOR and p-AMPK protein among groups of mice(±s, n=5)

有报道认为[4,8]肥胖糖尿病大鼠及高脂饮食导致小鼠肝自噬水平降低，胃旁路手术后可显著提高肝自噬，降低肝脂质沉积；但也有[5]报道认为在7周时高脂饮食并没有引起肝细胞自噬水平的改变。本研究中两组小鼠进食热量一致，但饮食结构不同导致高脂组在8周已出现内脏肥胖，同时肝细胞LC3Ⅱ表达稍增加，提示在高脂诱导肥胖小鼠初期，肝细胞自噬没有被抑制，甚至有短暂的上调。12、16周高脂饮食小鼠肝脏脂滴增多增大，LC3Ⅱ表达下降，P62明显增多，均提示肝细胞内自噬下调甚至衰竭。本研究结果与报道[5,9]高脂作用初期，胰岛β细胞自噬水平增强，随着高脂作用时间延长，细胞自噬下调甚至衰竭相一致。这可能是肥胖早期机体为适应环境改变启动自我保护机制，但随着肥胖的加重，这种自我保护机制很快被破坏。

自噬众多的信号调节通路中mTOR蛋白是自噬发生的主要抑制蛋白，p-AMPK可抑制mTOR活性从而活化自噬[6]。本研究结果表明高脂饮食小鼠肝脏自噬水平下调与p-AMPK/mTOR信号通路密切相关，与新近报道[10]一致。本研究同时发现高脂饮食8周时肝细胞自噬水平有短暂上调，与p-AMPK降低，p-mTOR表达增加相矛盾，提示高脂诱导的肥胖早期，小鼠肝细胞自噬短暂轻度上调可能与p-AMPK/mTOR信号通路之外的其他通路有关，具体调节机制还有待于进一步研究。

综上所述，小鼠肝细胞自噬在高脂饮食作用下呈动态改变，在高脂饮食初期肝细胞自噬水平短暂轻度增加，但长期高脂饮食可导致肝细胞自噬水平显著下调甚至衰竭，肝细胞自噬水平下调与高脂饮食抑制肝细胞p-AMPK表达及增加p-mTOR的活性有关。

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High-fat diet suppresses hepatic autophagyviap-AMPK/mTOR signal channel in mice

XU Ling*, MA Hong-yan, YANG Jun, GAO Chen-lin

(Dept. of Endocrinology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo investigate the effects of high fat diet on hepatic autophagy in mice and analyze the possible mechanism.MethodsC57BL male mice were fed with either normal diet or high-fat diet (HFD) for 8,12 or 16 weeks.The mice were sacrificed after measuring the body weight. The mesentery and epididymal fat tissue weight，the liver weight and the hepatic lipid accumulation were detected. The expression of hepatic AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) protein and autophagic markers including LC3Ⅱ, P62 protein were measured by Western blot.ResultsHFD-fed mice displayed significantly heavier body weight at 16 weeks and significantly heavier intra abdominal fat weight and lipid overaccumulation in liver at 8,12,16weeks(allP<0.01). Western blot showed hepatic LC3Ⅱ expression was up-regulated mildly in HFD fed mice at 8 weeks(P<0.05), but the change dramatically was reversed, hepatic LC3Ⅱ was significantly lower in HFD fed mice at 12,16 weeks, as well as P62 was increased in HFD fed animals(allP<0.05). HFD suppressed phos-phorylation of AMPK and increased phosphorylation of mTOR levels in liver at 8,12,16 weeks, compared to the normal-diet fed mice.ConclusionsOur data demonstrate that hepatic autophagy is in dynamic change in high-fat diet mice, long term high-fat diet severely suppressed hepatic autophagy, which is associated with decreased p-AMPK and increased p-mTOR.

autophagy; hepatic cell; high fat diet

2016- 12- 15

2017- 03- 23

四川省卫生厅科研项目(120330)

*通信作者(correspondingauthor)：houyf123@126.com

1001-6325(2018)01-0037-05

R363.2

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