Akt在Islet- 1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的作用

2018-01-10赖星宇陈雪妮

基础医学与临床 2018年1期

关键词：充质心肌细胞干细胞

赖星宇，朱静*，田杰,2，易勤，陈雪妮

(重庆医科大学附属儿童医院 1.儿科研究所儿童发育与疾病研究教育部重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿科学重庆市重点实验室；2.心血管内科，重庆 400014)

研究论文

Akt在Islet- 1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的作用

赖星宇1，朱静1*，田杰1,2，易勤1，陈雪妮1

目的研究Akt在Islet- 1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程的作用以及机制。方法构建过表达Islet- 1细胞模型；流式细胞计量术检测转染效率；CCK- 8检测细胞增殖；Western blot检测Islet- 1、cTnT和p-Akt/T-Akt蛋白表达；RT-qPCR检测心肌早期特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2cmRNA表达。结果随着MK- 2206(Akt抑制剂)浓度的增加，细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，对Akt活性的最佳抑制浓度为8 nmol/L；随着Islet- 1诱导分化时间的延长，感染细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达降低(P<0.05)，心肌特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表达升高(P<0.05)；而经MK- 2206处理的感染细胞，GATA4、Nkx2.5和Mef2c的复制在第1周时出现明显升高后又逐渐降低(P<0.05)。结论Akt在Islet- 1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用。

Islet- 1；Akt；MK- 2206;间充质干细胞；心肌细胞

干细胞经过一定条件的诱导能定向分化为心肌细胞以替代受损的心肌而达到治疗心肌损伤性疾病的效果，其中以间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为种子细胞移植治疗备受关注[1- 3]。本课题组前期研究证实，心脏发育早期转录因子Islet- 1[4]，能引导组蛋白乙酰转移酶(如GCN5和P300等)调控心肌特异基因表达[5]，同时GCN5募集蛋白复合体有调控MSCs分化的特性，而蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)可与含GCN5的复合体直接或间接作用，调节细胞增殖和分化[6]，达到MSCs定向分化为心肌细胞的目的。但Akt在此心肌细胞特异分化中扮演的角色尚不明确。本研究采用过表达Islet- 1的慢病毒感染C3H10T1/2间充质干细胞，促其向心肌细胞特异分化，以此探讨Akt在此特化过程中是否发挥重要作用以及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

C3H10T1/2细胞系(美国芝加哥大学分子肿瘤实验室)；DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；CCK- 8检测试剂盒(ATGene公司)；MK- 2206(Cayman公司)；Islet- 1单克隆抗体(Epitomices公司)；cTnT和p-Akt/T-Akt单克隆抗体(Abcam公司)；RNA提取试剂盒(百泰克公司)；反转录和real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；全蛋白提取试剂盒和ECL检测试剂盒(凯基生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 过表达Islet- 1的慢病毒载体构建：过表达小鼠Islet- 1基因的慢病毒载体构建、包装、纯化、鉴定和病毒滴度测定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成，方法同参考文献[7- 8]。

1.2.2 慢病毒感染C3H10T1/2细胞及感染率检测：待细胞增殖60%汇合时以Moi=20用相应量的病毒感染细胞，4:1的比例加入无血清培养基和感染增强液(enhanced infection solution, ENi.S.)，同时加入polybrene，使最终浓度为5 mg/L，37 ℃、5% CO2培养24 h，将分化培养基换为完全培养基。待96 h细胞荧光蛋白表达稳定后通过流式细胞计量术检测阴性对照组和实验组的感染效率。

1.2.3 实验分组:本实验分为空白组、阴性对照组(感染慢病毒空载体的C3H10T1/2细胞)和实验组(实验组分为感染高表达Islet- 1基因慢病毒载体的C3H10T1/2细胞组和MK- 2206处理的感染高表达Islet- 1基因慢病毒载体的C3H10T1/2细胞组)。实验组从病毒感染开始计算时间，分为4个时间点(即1、2、3和4周)，其中MK- 2206处理组是在感染病毒载体的基础上加入8 nmol/L MK- 2206试剂共同培养。

1.2.4 CCK- 8检测细胞增殖/活力：各组细胞以3×103个/孔接种于96孔板培养24 h,分别加入10 μL 1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 nmol/L的MK- 2206试剂，培养48 h，各孔加入10 μL WST- 8 solution，共培养2 h，450 nm检测吸光度值。

1.2.5 Western blot检测Islet- 1、cTnT和T-Akt/p-Akt蛋白表达水平：各组细胞全蛋白提取按说明书操作，BCA法测定蛋白浓度。配制10% SDS-PAGE胶，上样电泳后将所需蛋白湿转到PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭液封闭1 h，加入一抗，4 ℃摇床孵育8～9 h，PBST洗膜3次后按一抗来源加入对应的二抗，室温孵育1 h，PBST清洗3次后，避光加入ECL显色剂并显影。

1.2.6 RT-qPCR检测心肌特异早期基因的mRNA时序性表达情况：按说明书操作提取各组细胞RNA，反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增。每次扩增均设空白孔，各组样本均设3个复孔，以β-actin为内参，以2-ΔΔCt表示基因的相对表达量，基因引物序列如下(表1)。

1.3 统计学分析

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

2 结果

2.1 过表达Islet- 1慢病毒感染C3H10T1/2细胞的感染效率和细胞模型鉴定

阴性对照组为慢病毒仅携带绿色荧光蛋白(GFP)基因感染细胞，实验组为慢病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)及目的基因Islet- 1感染细胞，流式细胞仪检测带绿色荧光的细胞占总细胞的百分比，即为慢病毒携带基因的感染效率。流式细胞计量术检测结果显示，阴性对照组的感染效率为89.7%(图1A)，实验组的感染效率为94.7%(图1B)。实验组细胞的Islet- 1蛋白表达水平明显高于空白组和阴性对照组细胞(P<0.05)(图2)。

2.2 Islet- 1对间充质干细胞C3H10T1/2向心肌样细胞特异分化的作用

感染Islet- 1慢病毒的C3H10T1/2细胞心肌特异性蛋白cTnT的表达水平明显高于空白组和阴性对照组(图3)。

A.negative control group; B.experimental group图1 慢病毒感染效率Fig 1 Lentivirus infection efficiency

*P<0.05 compared with blank and negative control group图2 Islet- 1蛋白的表达Fig 2 Expression of Islet- 1 protein(±s，n=3)

2.3 Akt特异性抑制剂MK- 2206对感染后C3H10T1/2细胞的增殖以及p-Akt蛋白表达的影响

2.3.1 不同浓度MK- 2206对Islet- 1感染后C3H101/2细胞增殖的影响：随着药物浓度的增加，细胞增殖抑制率也逐渐增加(图4)。

2.3.2 不同浓度MK- 2206处理Islet- 1感染后细胞p-Akt蛋白的表达情况：随着药物浓度的增加，感染后细胞p-Akt蛋白表达水平依次降低，并在8 nmol/L时达到最低，表明MK- 2206对感染后细胞Akt活性的最佳抑制浓度为8 nmol/L(图5)。

2.4 感染过表达Islet- 1后细胞p-Akt/T-Akt蛋白表达情况

实验组p-Akt/T-Akt蛋白表达随着时间延长逐渐降低，于第3周达到最低，且实验组各周细胞均低于空白组和阴性对照组细胞(P<0.05)(图6)。

图4 细胞增殖抑制率Fig 4 Inhibitory rate of cell proliferation

2.5 慢病毒感染C3H10T1/2细胞以及经MK- 2206处理后细胞心肌早期特异基因的时序表达情况

LV-Islet- 1组心肌早期转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的mRNA表达随着时间延长依次升高，在第3周达最高，且各周细胞均高于空白组和阴性对照组细胞(P<0.05)；而LV-Islet- 1+MK- 2206组，与第1周相比各早期转录因子的mRNA表达逐渐降低，在第3周达到最低(P<0.05)(图7～9)。

3 讨论

MSCs向心肌细胞特异性分化是一个复杂而有序的过程，主要涉及细胞间直接作用、表观遗传修饰和信号通路等[9]。本研究以信号通路为切入点，着重探讨Akt在Islet- 1诱导MSCs向心肌细胞分化过程中的作用。已有研究提示, Akt信号通路在真核细胞的存活、增殖和分化等过程中发挥重要作用[10]，并且其对细胞分化的调控可能在分化不同阶段扮演不同的角色[11]。本课题组前期证实，GCN5与募集蛋白因子形成的转录延伸复合物可通过Akt的胞核胞质转移，协同转录辅助激活子，调控具有Sp1结合位点的基因转录，而Sp1可与Mef2和GATA4协同调控心肌肌钙蛋白cTNI基因的表达[6]。

*P<0.05 compared with other concentration group图5 p-Akt蛋白的表达Fig 5 Expression of p-Akt protein(±s，n=3)

*P<0.05 compared with blank and negative group图6 p-Akt/T-Akt蛋白的表达Fig 6 Expression of p-Akt/T-Akt protein(±s，n=3)

A.*P<0.05 compared with blank and negative group; B.*P<0.05 compared with the first week of LV-Islet- 1+MK- 2206 group

A.*P<0.05 compared with blank and negative group; B.*P<0.05 compared with first week of LV-Islet- 1+MK- 2206 group

本实验结果表明， Islet- 1成功诱导MSCs向心肌细胞特异分化。另外，在此过程中Akt活性降低，则提示Akt活性在Islet- 1促分化过程中与分化程度可能呈负相关，此与普遍认为的Akt促分化结论不同。故用Akt特异抑制剂MK- 2206处理Islet- 1诱导的细胞，观察Akt被抑制后能否进一步促分化，但是，心肌早期特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的表达在Akt被抑制1周时升高，在2～3周时降低，而在第4周又升高。因此，证实了Akt对分化的调控可能在分化不同阶段发挥着不同的作用。在MSCs处于自我更新状态时，Akt调节下游OCT4、SOX2和Nanog等多能干性因子维持MSCs的干性，此时Akt阻碍MSCs分化；当MSCs受诱导后，Akt活性降低引起干性因子表达下降，细胞进入分化状态，此时Akt转为促进MSCs分化[12]。综上所述，在Islet- 1促MSCs特异分化中，Islet- 1可通过Akt调控间充质干细胞的定向分化，但对于Akt与Islet- 1两者的相互关系及Akt在MSCs不同分化阶段所发挥不同功能的作用机制尚不明确。

本研究首次证实了Akt在Islet- 1诱导MSCs向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用，此为进一步提高干细胞向心肌细胞定向分化和靶点干预提供科学的理论依据和实验基础，为心肌损伤性疾病的细胞替代治疗提供新的研究视野。

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Role of Akt during Islet- 1 inducing C3H10T1/2 cells to differentiate specifically into cardiomyocytes

LAI Xing-yu1, ZHU Jing1*, TIAN Jie1,2, YI Qin1, CHEN Xue-ni1

(1.Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood Ministry of Education, China International Science and Technology Cooperation Base of Development and Critical Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Pediatric Research Institute;2.Dept. of Cardiology, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014,China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of Akt during Islet- 1 inducing the mesenchymal stem cells of C3H10T1/2 cells to differentiate specifically into cardiomyocytes.MethodsDeveloping a model of Islet- 1 over-expression cells, Lentivirus infection efficiency of cells was detected by flow cytometry detection technology. Cell proliferation was tested by CCK- 8. The protein expression of Islet- 1，cTnT and p-Akt/T-Akt was measured by Western blot. The mRNA expression ofGATA4，Nkx2.5 andMef2cwere tested by real-time PCR.ResultsWith the increasing of MK- 2206 concentration, the inhibition rate of cell proliferation increased(P<0.05), and the best inhibition concentration of Akt was 8 nmol/L; With prolongation of Islet- 1 inducing time，the protein expression of p-Akt/T-Akt reduced(P<0.05);The gene expression of myocardial specific transcription factorGATA4,Nkx2.5 andMef2cincreased(P<0.05)；treated with MK- 2206, the geneexpres-sion ofGATA4,Nkx2.5 andMef2cincreased significantly at the first week and then reduced(P<0.05).ConclusionsAkt plays different effects in different differentiation stages during the Islet- 1 inducing the cells into cardiac-specific differentiation process.

Islet- 1; Akt; MK- 2206; mesenchymal stem cells; cardiomyocyte

2016- 12- 01

2017- 03- 21

国家自然科学基金(81670270)

*通信作者(correspondingauthor)：jingzhu@cqmu.edu.cn

1001-6325(2018)01-0013-07

R394.3