追风透骨胶囊对类风湿关节炎大鼠关节滑液及滑膜组织中miR-155、TGF-β1表达的影响*

柳庆坤 梁云清 刘 伟 吴 剑

（河北省安国市医院，河北 安国 071200）

类风湿关节炎（RA）是一种复杂的、多系统的、以多关节滑膜组织慢性炎症为显著特征的自身免疫系统疾病，其发病率及致残率极高，严重危害人类健康［1］。因其发病机制复杂且不明确，成为临床较难根治的疾病之一。目前针对RA的治疗主要以西药和生物疗法为主，但西药的毒副作用大、生物制剂的价格昂贵等缺点，导致临床适用性较差，难以普遍推广。近期有关研究提出，RA由多个组织器官病变引起，与中医药多环节、多靶点治疗特点不谋而合［2］。其中追风透骨胶囊（ZFTG）以疏通经络、祛风湿、镇痛祛寒的功效［3］及疗效好、副作用小、患者依从性强等优势，逐渐成为RA治疗的首选。基于此，本文通过研究中药复方制剂ZFTG对RA大鼠关节滑液及滑膜组织中微小RNA-155（miR-155）、转化生长因子（TGF-β1）表达的影响阐述其治疗RA的作用机制，为其临床推广提供理论依据。现报告如下。生炎症进行造模。取建模成功的大鼠60只随机分为6组， 分别为模型组、ZFTG 低剂量组 ［200 mg/（kg·d］、ZFTG 中 剂 量 组 ［400 mg/（kg·d）］、ZFTG 高 剂 量 组［800mg·（kg/d）］、阳性对照组（每天给予地塞米松 2mg/kg），模型组与正常组每日分别以等量的 （4 mL）0.9%氯化钠注射液灌胃。分别于造模第7日开始给药，连续给药4周。

1.6 标本采集与检测 给药后第28日以脱颈法将大鼠处死，滑膜液取样：无菌条件下，以镊子拉开造模足踝关节，以注射器吸取关节滑膜液，保存于-80℃冰箱中备用。关节滑膜组织的留取：沿后肢膝关节正中纵行切开，暴露出膝关节中心约3 cm×3 cm的区域，无菌剥离出滑膜组织，以无菌0.9%氯化钠注射液清洗后，快速放入1‰DEPC处理的EP管中，备用。1）大鼠足肿胀程度测定。分别以容积检测仪测定并记录各组给药后第 7、14、20、24、28 日大鼠右后足的肿胀体积变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用性成熟的SPF级健康未交配SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±20）g，购自北京农学院，动物合格证号SYXK（京）2015-0004；饲养环境：室温18～22℃、相对湿度40%～50%、标准饲料和水饲养。

1.2 仪器与试剂 足趾容积检测器，型号KY811，北京凯云仪科技有限公司；荧光定量PCR仪，北京时代新维测控设备有限公司。Ⅱ型胶原，10 mg/支，购于上海本草生物医学工程研究所；弗氏完全佐剂，10 mg/支，购于北京华越洋生物科技有限公司；TGF-β1、ELISA试剂盒，均购于上海恒远生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；Western blot印迹全套试剂盒，购于上海西宝生物科技有限公司。

1.3 实验药品 ZFTG，批准文号为国药准字Z20083219，规格为0.26 g/粒，厂家为湖南德康制药股份有限公司；地塞米松片，批准文号为国药准字H44024276，规格为0.75mg/片，厂家为广东三才石岐制药有限公司。

1.4 试药的配制 ZFTG灌胃溶液制备，分别称取ZFTG内容物2.5 g，5 g，10 g于50mL量瓶中，以0.9%氯化钠注射液稀释并定至刻度，摇匀，即得ZFTG低剂量、中剂量、高剂量混悬液 （质量浓度分别为0.05 g/mL、0.1 g/mL、0.2 g/mL）；CⅡ乳剂的制备： 无菌条件下，取Ⅱ型胶原以0.1 moL/L的冰乙酸充分溶解制得浓度为2mg/mL，置于4℃冰箱中静置过夜，与弗氏完全佐剂等体积混合，振荡乳化即得（每1mL含1mg CⅡ），于4℃冰箱中保存备用。

1.5 造模与分组 取80只大鼠，随机选出10只为空白组，其余70只均参照文献［4-5］方法，以CⅡ乳剂于每只大鼠左后足跖进行皮内注射0.25 mL，诱导其发2）大鼠滑液及滑膜组织中miR-155、TGF-β1基因表达水平的测定。以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定大鼠关节滑液及滑膜组织中miR-155的相对表达量：以RNA提取试剂盒，提取大鼠关节滑液及滑膜组织的总RNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行；使用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，进行qRT-PCR，PCR的反应体系为：5X缓冲液5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，上游引物F 1 μL，下游引物 R 1 μL，10 mM dNTPmix 0.5 μL，cD NA 0.5μL，ddH2O 16.5μL；PCR 的反应条件如下。 预变性：94℃ 3min。变性：94℃ 30 s。 退火：55℃ 15 s（miR-155和GAPDH）。延伸：72℃ 1min，25个循环。再延伸：72℃5min。引物序列均由广州华大生物科技有限公司完成；引物序列，miR-155上游引物F：5′-CTGTTAATGCTAATTGTGAT-3′。 下游引物 R：5′-CTGTTAATGCTAACAGGT AG-3′；TGF-β1 上游引物 F：5′-GGGAAGAGGTCCCTGAGACC-3′。 下游引物 R：5′-AGTCAAATTTGTTTTA AGCT-3′。 3）大鼠滑液及滑膜组织中TGF-β1蛋白表达水平的测定。采用酶联免疫吸附 （ELISA）法测定大鼠关节滑液中TGF-β1的含量，步骤严格按照操作说明书进行，以蛋白免疫印迹（Western blot）法［6］检测关节滑膜组织中 TGF-β1 蛋白的表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料用百分率（%）表示，组间差异分析采用χ2检验。P＜0.05表示两组差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠足肿胀体积比较 见表1。模型组及各治疗组肿胀体积均大于空白组；随ZFTG剂量的增加，肿胀体积逐渐减小（P＜0.05）。

表1 各组大鼠足肿胀体积比较（mL，±s）

表1 各组大鼠足肿胀体积比较（mL，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阳性对照组比较，△P＜0.05。 下同。

24 d 28 d 1.20±0.09 1.23±0.17 1.82±0.12* 1.85±0.14*1.59±0.13# 1.67±0.19#ZFTG 低剂量组 10 1.56±0.12△ 1.58±0.11△ 1.68±0.14△ 1.76±0.18△ 1.82±0.16△ZFTG 中剂量组 10 1.43±0.17# 1.49±0.14# 1.52±0.16# 1.57±0.17# 1.65±0.12#ZFTG 高剂量组 10 1.36±0.13#△ 1.38±0.12#△ 1.41±0.14#△ 1.45±0.15#△ 1.51±0.14#△组 别 n空白组 10模型组 10阳性对照组 10 7 d 14 d 20 d 0.96±0.12 1.05±0.14 1.14±0.12 1.58±0.11* 1.67±0.16* 1.78±0.14*1.45±0.14# 1.48±0.15# 1.54±0.16#

2.2 各组大鼠关节滑液中miR-155、TGF-β1表达的比较 见表2。模型组及各治疗组大鼠关节滑液中miR-155及TGF-β1的表达均高于空白组；随ZFTG剂量的增加，miR-155及TGF-β1的表达水平均逐渐下调（P＜0.05）。

表2 各组大鼠关节滑液中miR-155、TGF-β1表达比较（±s）

表2 各组大鼠关节滑液中miR-155、TGF-β1表达比较（±s）

TGF-β1mRNA TGF-β1蛋白0.75±0.06 1.37±0.12 1.96±0.16* 3.42±0.27*1.45±0.13# 2.19±0.24#ZFTG低剂量组 10 1.68±0.28△组 别 n miR-155空白组 10 0.52±0.04模型组 10 1.89±0.16*阳性对照组 10 1.25±0.12#1.78±0.22△ 2.94±0.40△ZFTG 中剂量组 10 1.49±0.16# 2.02±0.28# 1.17±0.16#ZFTG 高剂量组 10 0.82±0.09#△ 1.49±0.19#△ 0.61±0.05#△

2.3 各组大鼠滑膜组织中TGF-β1mRNA及蛋白表达比较 见表3。模型组及各治疗组大鼠关节滑膜组织中miR-155的表达水平均高于空白组；随ZFTG剂量的增加，miR-155的表达水平逐渐下调 （P＜0.05）。模型组及各治疗组大鼠关节滑膜组织中TGF-β1mRNA及蛋白表达水平均高于空白组；随ZFTG剂量的增加，TGF-β1 mRNA及蛋白的表达水平逐渐下调（P＜0.05）。

表3 各组大鼠滑膜组织中miR-155基因、TGF-β1mRNA及蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠滑膜组织中miR-155基因、TGF-β1mRNA及蛋白表达比较（±s）

TGF-β1mRNA TGF-β1蛋白0.78±0.03 1.68±0.24 1.86±0.06* 3.75±0.32*1.28±0.18# 2.54±0.25*ZFTG低剂量组 10 1.71±0.19△组 别 n miR-155空白组 10 0.69±0.07模型组 10 1.79±0.17*阳性对照组 10 1.19±0.11#1.76±0.15△ 3.39±0.46△ZFTG 中剂量组 10 1.32±0.19# 2.62±0.19# 1.03±0.12#ZFTG 高剂量组 10 1.06±0.23#△ 1.98±0.12#△ 0.81±0.09#△

3 讨 论

RA是一种全身性的自身免疫系统疾病，主要临床表现为慢性全身多关节炎症，其病变往往具有持续、多发性及反复发作过程，给患者带来极大痛苦。大量药理试验及临床研究［7-10］表明，RA的发病机理与血清、关节滑液及关节滑膜组织中的多种细胞因子、抗原抗体、转化生长因子、黏附因子及核酸片段等相关表达水平关系密切，但因体内各种细胞因子间存在相互反馈调节机制，增加了RA病机研究的难度，目前RA的具体发病机制仍未完全明确。针对RA发病机理的不确定性及致病因子的多样性，临床的治疗手段亦由最初的传统西药针对临床炎症的治疗转变为针对关节滑液及滑膜组织中的相关致病因子的调节治疗。

ZFTG主要是由制川乌、香附、川芎、麻黄、制草乌等20多味中药组成的复方制剂，具有祛风除湿、通经活络、散寒止痛的功效，临床用于风寒湿痹、四肢痹痛及手足麻木等症。彭红英等［11］研究表明，ZFTG具有抗炎、镇痛及免疫抑制的功效，能显著改善大鼠关节肿胀，但其具体的作用机制并未得到明确阐述。

microRNA （miRNA）是一类非编码的长约19～24个核苷酸的RNA，其可通过调控基因的表达，参与机体多种生物学过程［12］。作为其中一个典型的多功能miRNA，越来越多的研究表明miR-155参与体内多种细胞形成、炎症和免疫反应等多种机体调节过程［13］。但针对其在RA调控方面的作用，目前仍有保护及促炎两种观点［14］。虽有不少文献报道，miR-155可参与调节T淋巴细胞的增殖、分化，而产生抑制炎症反应发生的作用［15-16］。但目前更多关于RA的研究表明，miR-155对RA关节滑膜炎症产生正性反应［17］，即显示出其促炎作用。本研究结果表明，模型组大鼠关节滑膜组织中miR-155的表达水平均显著高于空白组，与文献报道其在RA的免疫调节中促炎作用相一致，表明miR-155的表达上调可能与RA致病机理有关。

在参与炎症反应的各种因子中，TGF-β1作为具有双向调节作用的细胞因子，既可促进炎症细胞的活化，又可促进血管增生及组织修复［18］。TGF-β1广泛分布于机体的各种组织细胞，在不同类型的细胞中其表达水平及作用均有差异。作为一种重要的调节细胞生长、分化的多肽类因子，其表达水平的高低与RA的发病过程关系密切。国外研究表明，RA患者血浆及血清中TGF-β1的水平均高于正常对照组，显示其表达水平与炎症及免疫反应的正性调节作用［19-21］。本研究结果表明，模型组大鼠关节滑液及滑膜组织中TGF-β1的表达水平均显著高于空白组，与上述报道一致，表明TGF-β1的表达上调可能与RA的致病机理有关。

另外本研究结果显示，治疗28 d后，各治疗组大鼠右后足肿胀体积均减小，随ZFTG剂量的增加，肿胀体积逐渐减小，表明ZFTG可缓解RA大鼠的临床病症，且其疗效具有剂量相关性。治疗28 d后，各治疗组大鼠关节滑液及滑膜组织中miR-155的表达、TGF-β1mRNA及蛋白的表达水平均下调；且随ZFTG剂量的增加，miR-155的表达、TGF-β1蛋白及mRNA的表达水平均逐渐下调，此结果表明表明ZFTG治疗RA的作用机理可能与下调miR-155、TGF-β1的表达水平有关，且ZFTG的下调效果具有剂量相关性。

综上所述，ZFTG可能通过下调类风湿关节炎大鼠关节滑液及滑膜组织中miR-155、TGF-β1的表达等机制达到缓解类风湿关节炎临床症状及治疗RA的目的，为其临床推广提供理论依据，亦为RA治疗机理的研究提供参考。

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