痛泻安肠方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠NGF/PLC-γ/TRPV1信号通路表达的干预效应*

韩亚飞 石 磊 贾博宜 毛堂友 郭 一 王允亮 谢添弘 陈 晨 谭 祥 李军祥 △

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）为功能性胃肠道疾病，以腹痛、腹泻为主要临床表现，但缺乏可解释的病理改变。目前，IBS-D的发病机制尚不明确，研究证实内脏敏感性增加是IBS-D发病的关键因素［1-2］。神经生长因子（NGF）作为重要的参与痛觉过敏的物质，介导的NGF/激活磷脂酶C-γ （PLC-γ）/瞬时受体电位香草酸亚型-1（TRPV1）信号通路在IBS-D的发病中发挥着重要作用。因此，本研究以NGF/PLC-γ/TRPV1信号通路为切入点，探讨痛泻安肠方治疗IBS-D内脏高敏感性的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠72只，SPF级，体质量（120±20） g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，合格证号SCXK（京）2016-0002，饲养在北京中医药大学东方医院动物中心，许可证编号SYXK（京）2014-0008。普通饲料适应性喂养1周。

1.2 试药与仪器 痛泻安肠方水煎剂（炒白术15 g，炮姜 9 g，炒白芍 12 g，乌梅 9 g，蜘蛛香 6 g，黄连 6 g，蝉蜕 6 g，0.5 g 生药/mL），匹维溴铵片（得舒特），中药饮片由北京中医药大学东方医院中药房提供，阳性药物匹维溴铵由法国苏威特制药公司生产（批号H20070059）。乙酸（北京化学试剂公司，货号CAS64-19-7）；液体石蜡 （北京化学试剂公司）；MEDEX中心静脉导管 （单腔）（美国）；BARD-FOLEY双腔儿科导尿管 （美国）；TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司，货号DP405-02）；消除gDNA反转录试剂盒 （宝生物公司，货号RR047B）、Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒（宝生物公司，货号RR82LR）、DL2000 DNA Marker（宝生物公司，货号 3427Q）；RIPA 总蛋白提取试剂盒（Sigma公司，货号Cat No.R0278）、苯甲基磺酰氟（Sigma公司，货号 Cat No.PMSF-RO）、BCA 蛋白定量试剂盒（Sigma公司，货号Cat.No.BCA1）；蛋白酶抑制剂 （Roche公司，货号Cat No.11697498001）；GAPDH鼠单抗（天津锐尔康生物科技有限公司，货号Cat No.REK0005）；山羊抗兔 IgG（H+L，）/HRP（Jackson公司，货号 Cat No.111 035003）、山羊抗鼠 IgG（H+L）/HRP（Jackson 公司，货号 Cat No.115035003）。实验仪器：BT224S电子天平（德国Sartouris公司）；QL-902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；NANODROP 2000分光光度计 （Therno scientific公司）；ABI7500荧光定量PCR仪 （美国Applied Biosystems公司）；NuPAGE蛋白电泳系统 （美国Thermo公司）；Centrifuge 5415D 离心机（Eppendorf公司）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo公司）；Mini Ge Tank电泳仪（Therno scientific公司）。

1.3 分组与造模 制备模型前运用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、痛泻安肠方高剂量组（按正常人用标准计量2倍换算）、痛泻安肠方中剂量组（按正常人用标准计量换算）、痛泻安肠方低剂量组（按正常人用标准计量1/2倍换算）和匹维溴铵组，每组12只。空白组和模型组给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃，中药组给予痛泻安肠方水煎剂13.20 g/（kg·d）、6.60 g/（kg·d）、3.30 g/（kg·d）灌胃治疗，匹维溴铵组给予20mg/（kg·d）的水溶液等体积灌胃治疗。模型制备方法如下。 1）冰醋酸灌肠：参照 AL-Chaer ED［3］的造模方法，将大鼠倒置，用石蜡将中心静脉导管润滑，将0.5%的冰醋酸经肛门插入距肛缘3～5 cm处，为防止冰醋酸漏出，用手按住肛门约1min，灌注量从0.2mL开始，逐渐增加至0.7 mL，持续2周。2）球囊直肠刺激：用石蜡将双腔导尿管球囊端润滑，经肛门插入距肛缘 2～3 cm 处，向球囊中充气 1.5～2.0 mL/次，以大鼠出现腹部收缩为度，共扩张3次，同时给予夹尾刺激，持续时间3～5min，持续2周。在冰醋酸灌肠、球囊直肠刺激联合夹尾刺激的同时予番泻叶浓缩剂［0.5 g/mL）灌胃，给药体积为 20mL/（kg·d）］，持续 4 周。

1.4 标本采集与检测 末次给药后，将大鼠禁食禁水24 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，取距离大鼠肛门约8 cm处的结肠组织，放入冻存管内，经生理盐水冲洗干净后置于液氮内冻存，之后放入-80℃冰箱保存待测。1）一般情况：分别观察大鼠的精神状态、进食、体质量、活动情况、毛发及大便性状等情况。2）内脏敏感性评价：腹壁撤退反射（AWR）评分检测大鼠内脏敏感性。本实验共42 d，分别于第28、42日对各组大鼠进行AWR评分，评分前将大鼠24 h禁食不禁水。具体操作：在10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉状态下，将石蜡油浸润后的双腔导尿管球囊端插入距肛缘约1.0 cm的位置，用胶带将导管固定在大鼠尾巴根部，将其放入特制的透明观察箱内，大鼠在该箱内不能转身只能前后活动，待其适应30min后开始向球囊内充气扩张肠道，容量分别为1.0、1.5、2.0 mL，每次间隔10 min。每只大鼠重复上述步骤3次，取3次的平均值。AWR评分标准［4］：0分，结直肠扩张刺激时大鼠情绪基本稳定；1分，给予刺激时变得开始不稳定，偶尔扭动头部；2分，给予刺激时腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；3分，刺激时腹背部肌肉较强烈收缩并出现腹部抬离地面的情况；4分，腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形，并把腹部、会阴部抬离地面。3）腹泻评价：粪便Bristol分级评分和粪便含水量检测大鼠的腹泻情况。分别于第28、42日对实验大鼠进行粪便Bristol分级评分，同期采集大鼠 4 h（8∶00～12∶00am）粪便并称重（湿重），干燥后再称重（干重），计算出各组大鼠在治疗前后其粪便含水量的变化，正常组同期观察。 粪便含水量（%）＝（湿重-干重）/湿重×100%。 粪便Bristol分级评分标准［5］：1 型分散的硬块，如坚果；2 型腊肠状，成块的；3型腊肠状，表面有裂缝；4型腊肠状或蛇状，光滑而柔软；5型柔软团块，边缘清楚；6型绒状便，边缘不清，或糊状粪；7型水样粪，无固状物。4）结肠NGF、PLC-γ和TRPV1的检测：采用Western blot检测NGF、PLC-γ和TRPV1的表达。先进行蛋白提取，加入0.1 M PMSF母液，预冷RIPA蛋白抽提试剂，肠组织以100mg加入200μL裂解液为基准，充分匀浆，在冰上孵育30min，4℃离心，离心完成后取上清液；加入BSA标准液，检测样品蛋白含量；以RIPA调整蛋白浓度，根据目的蛋白的分子量，配制浓度为5%的浓缩胶，分离电泳，湿转法进行转膜，封闭，用3%BSA-TBST 稀释一抗，NGF （1∶500），PLC-γ （1∶1000），TRPV1（1∶1000），用 5%脱脂奶粉-TBST 稀释一抗种属对应二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP和山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP，（1∶20000），TBST 洗膜，定影；加 GAPDH鼠单抗，加入二抗，洗膜后进行凝胶图像分析，最终得出数值。 5）结肠 NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA 的检测：采用 Real-Time PCR 检测 NGF、PLC-γ、TRPV1 mRNA的表达。进行引物设计，用超纯RNA提取试剂盒进行组织样本RNA提取，使用NanoDrop ND-2000测定RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA后再进行PCR扩增，以2-△△ct作为目地基因对数据进行相对定量分析。NGF、PLC-γ、TRPV1、GAPDH 引物序列见表 1。

表1 NGF、PLC-γ、TRPV1、GAPDH 引物序列

1.5 统计学处理 应用IBM SPSSStatistics 22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，对符合正态分布且方差齐的数据，其组间差异采用单因素方差分析，继以LSD-t检验方法进行两两比较，不服从正态分布或方差不齐的数据采用非参数检验，继以Games-Howell检验方法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 实验期间，各组无大鼠死亡。空白组大鼠精神状态良好，反应灵敏，体质量增加，饮食正常，活泼好动，毛发光泽整齐，大便呈颗粒状。造模开始第3日起，除空白组外，大鼠精神略显萎靡，体质量增长缓慢或略下降，食量减少，活动减弱，毛发凌乱少光泽（个别大鼠伴见不同程度的脱毛情况），大便稀烂，肛门周围被稀便沾染。经灌胃治疗后，与模型组相比，各治疗组大鼠精神状况、毛发光泽、进食、活动情况及体质量等均有不同程度的好转，粪便性状由糊状便最终转为颗粒状。

2.2 各组大鼠治疗前后AWR评分比较 见表2。造模结束后，球囊充气量为1.0mL时，低剂量、中剂量和得舒特组与空白组大鼠相比，AWR评分均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；充气量为1.5 mL时，与空白组大鼠相比，中剂量、高剂量组AWR评分存在差异（P＜0.05），模型组、低剂量和得舒特组AWR评分有显著性差异（P＜0.01）；充气量为2.0mL时，低剂量组与空白组大鼠相比，AWR评分升高（P＜0.05）。治疗结束后，与空白组大鼠相比，模型组大鼠AWR评分均升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组大鼠相比，球囊充气量为1.0mL时，低剂量和高剂量组大鼠AWR评分均降低（P＜0.05）；充气量为 1.5 mL 时，低、中、高剂量组和得舒特组大鼠AWR评分均明显降低（P＜0.01）；充气量为2.0mL时，低剂量和中剂量组大鼠AWR评分均降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠治疗前后AWR评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠治疗前后AWR评分比较（分，±s）

与空白组同容量比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同容量比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别 时间 2.0mL空白组 治疗前 2.95±0.60（n＝12） 治疗后 2.92±0.34模型组 治疗前 3.48±0.50 1.0mL 1.5mL 0.75±0.27 1.72±0.68 0.80±0.19△ 1.83±0.19 1.38±0.61 2.88±0.58**（n＝12） 治疗后 3.45±0.45*1.33±0.43* 2.92±0.24**低剂量组 治疗前 1.47±0.50* 2.92±0.80** 3.62±0.45*（n＝12） 治疗后 0.85±0.36△ 2.05±0.39△△ 2.98±0.34△中剂量组 治疗前 1.50±0.70* 2.55±0.61* 3.38±0.53（n＝12） 治疗后 1.00±0.34 1.88±0.27△△ 2.95±0.36△高剂量组 治疗前 1.28±0.51 2.67±0.55* 3.42±0.61（n＝12） 治疗后 0.90±0.36△ 2.00±0.34△△ 3.08±0.27得舒特组 治疗前 1.45±0.70* 2.87±0.47** 3.50±0.58（n＝12） 治疗后 0.93±0.33 2.12±0.55△△ 3.05±0.36

2.3 各组大鼠粪便Bristol分级评分比较 见表3。造模结束后，模型组和各治疗组的大鼠粪便Bristol分级评分升高，且结果近似，与空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。治疗结束后，与模型组比较，各治疗组大鼠粪便Bristol分级评分均降低（P＜0.01），同时，其粪便Bristol分级评分与空白组接近。

2.4 各组大鼠粪便含水量比较 见表4。治疗之前，模型组和各治疗组大鼠粪便含水量的结果接近，与空白组相比，均有统计学差义（P＜0.01）。治疗结束后，各治疗组大鼠粪便含水量均低于模型组（P＜0.01），同时，其粪便含水量与空白组接近。

表3 各组大鼠粪便Bristol分级评分比较（分，±s）

表3 各组大鼠粪便Bristol分级评分比较（分，±s）

与空白组同期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n 第28日 第42日空白组 12 4.58±0.38 4.42±0.38模型组 12 6.25±0.27** 6.34±0.41**低剂量组 12 6.33±0.41** 4.50±0.45△△中剂量组 12 6.17±0.26** 4.75±0.27△△高剂量组 12 6.17±0.52** 4.58±0.58△△得舒特组 12 6.42±0.38** 4.67±0.75△△

表4 各组大鼠粪便含水量比较（%，±s）

表4 各组大鼠粪便含水量比较（%，±s）

组 别 n 第28日 第42日空白组 12 49.36±0.99 48.78±0.86模型组 12 62.24±1.31** 61.66±0.78**低剂量组 12 61.22±0.91** 50.11±3.16△中剂量组 12 60.08±1.15** 49.55±2.41△高剂量组 12 59.90±1.82** 50.24±1.43△得舒特组 12 60.67±2.08** 51.22±3.26△

2.5 结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达水平比较 见图1，表5。治疗结束后，与空白组相比，模型组大鼠结肠TRPV1蛋白表达升高（P＜0.05）；各治疗组大鼠结肠组织中NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达均低于模型组，其中，低剂量组大鼠结肠组织中NGF蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）；与模型组相比，中剂量和高剂量组大鼠结肠组织PLC-γ蛋白表达明显降低（P＜0.05）；低剂量和中剂量组TRPV1蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）；其余各组大鼠结肠组织蛋白表达与模型组无差异。

图1 各组大鼠结肠蛋白表达

表5 各组大鼠结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达灰度值比较（目的蛋白/内参蛋白，±s）

表5 各组大鼠结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达灰度值比较（目的蛋白/内参蛋白，±s）

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2.6 结肠 NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表达水平比较 见表6。治疗结束后，与空白组相比，模型组大鼠结肠组织中 PLC-γ、TRPV1 mRNA表达明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，低剂量、高剂量、得舒特组大鼠结肠组织PLC-γmRNA表达明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组大鼠结肠组织TRPV1 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。

表6 各组大鼠结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表达比较（目的基因/内参基因，±s）

表6 各组大鼠结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表达比较（目的基因/内参基因，±s）

组 别 n TRPV1/2-△△ct空白组 6 1.26±0.26模型组 6 2.17±0.60**低剂量组 6 1.33±0.15△△NGF/2-△△ct PLC-γ/2-△△ct 1.11±0.58 0.93±0.17 1.09±0.12 5.38±1.29**1.75±0.41 1.63±0.29△△中剂量组 6 1.20±0.37△△1.27±0.44 2.15±0.84*高剂量组 6 1.38±0.52 1.30±0.28△△ 0.90±0.13△△得舒特组 6 0.96±0.20 0.86±0.14△△ 1.35±0.15△△

3 讨 论

NGF是一种具有营养神经元和促进神经突起生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。近几年研究发现，神经生长因子在疼痛的产生及维持过程中也扮演着重要角色。NGF可以由多种细胞合成释放，蛋白酪氨酸激酶受体A（TrkA）是NGF的高亲和力受体，通过激活PLC-γ通路，降低TRPV1开放阈值，参与介导过度敏感现象［6］，是IBS-D内脏敏感性增加的关键通路。研究表明，IBS-D患者与健康人相比，血清和肠黏膜的NGF及其受体TrkA含量均显著升高；而靶向性抑制NGF能降低NGF和TrkA的水平，能有效改善IBS-D的内脏高敏感症状［7］。亦有研究显示，NGF能诱导结肠过敏，阻断NGF则能够缓解其高敏感性［8］。

TRPV1是一种配体门控非选择性的阳离子通道蛋白，对Ca2+具有高度通透性，能对细胞内或细胞外的机械性、温度性和化学性刺激激活，产生痛觉过敏和病理性疼痛。作为痛觉感知传导所必需的一个伤害性感受分子，在IBS内脏高敏感性发生中具有关键作用。临床研究［9］显示，TRPV1在 IBS患者乙状结肠的表达较正常人更高，并与患者的腹痛严重程度呈正相关。实验研究也发现感觉神经元TRPV1表达上调与内脏高敏感性疼痛的发生密切相关，是启动并保持胃肠道高敏感性的重要分子［10-11］。TRPV1基因敲除可以降低胃肠道传入神经在扩张刺激下的机械敏感性［12］。

反复的腹痛、腹泻是IBS-D患者的主要临床表现，而情绪的异常改变往往是其症状出现或加重的重要因素［13-14］。 根据患者“痛”“泻”等的临床表现，以及与情绪之间的密切联系，中医学将其归属于 “泄泻”“腹痛”“郁证”等范畴，其病机关键在于脾虚肝旺，脾虚湿盛［15］，正如《医方考》所记载“泻则之脾，痛则之肝；肝则之实，脾则之虚，脾虚肝实，故令痛泻”。痛泻安肠方是导师李军祥教授经过多年临床总结的临床经验方，在IBS-D的治疗中取得了显著的疗效，主要由炒白术15 g，炮姜 9 g，炒白芍 12 g，乌梅 9 g，蜘蛛香 6 g，黄连6 g，蝉蜕6 g组成。方中白术苦甘而温，补脾燥湿以治土虚，为君药；炮姜性温，善暖脾胃，能温中止痛止泻，与白术共为君药。白芍酸寒，柔肝缓急止痛，与白术相配，于土中泻木；乌梅酸涩性平，能涩肠止泻，与白术相配以收健脾止泻之功；味酸入肝，与白芍相配则加强柔肝止痛之力，与白芍共为臣药。蜘蛛香辛苦而温，理气止痛，除湿止泻；黄连清热燥湿，厚肠止泻；蝉衣气味甘寒，乃清虚之品，能祛风而胜湿，与黄连相配，防止湿邪入里化热，与蜘蛛香、黄连共为佐药。诸药相伍，乃仿痛泻要方之义，使脾健肝舒，气机调畅，痛泻自止。

本实验结果显示，IBS-D大鼠内脏敏感性阈值下降，粪便含水量和粪便Bristol分级评分均明显升高，结肠组织 NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达升高，结肠PLC-γ、TRPV1mRNA表达升高；痛泻安肠方治疗后内脏敏感性阈值升高，大鼠粪便含水量和粪便Bristol分级评分降低，且接近空白组，结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达下降，PLC-γ、TRPV1 mRNA 表达降低，说明痛泻安肠方能上调内脏敏感性阈值，下调结肠组织NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表达，降低结肠PLC-γ、TRPV1mRNA的表达，达到治疗IBS-D的目的。

但是实验结果显示，大鼠结肠组织中NGFmRNA的表达在治疗前后并未发生改变，肠道功能的变化是否主要体现在蛋白的表达上以及基因是否参与肠道功能的变化仍需进一步验证，NGFmRNA的表达是否与NGF的表达同步尚需进一步研究。

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