凝乳酶热失活动力学研究

武彬+刘雪兰+石天虹+阎佩佩+伦忠杰+王昭霖+井庆川

摘要：为研究凝乳酶在334～343 K熱失活动力学表现，利用Arrhenius方程，分别计算得到了不同温度下，凝乳酶的热失活速率常数k、半衰期t1/2，并最终计算得到了凝乳酶的失活活化能Ea为（539.58±1.55）kJ/mol。335～343 K时，数据线性回归拟合结果较好，凝乳酶的热失活符合一级反应动力学规律。在较低的334 K时，失活速率常数的线性回归分析拟合度较低，凝乳酶在保温前期失活速率常数偏高，而后期偏低，曲线斜率前后差别显著，提示凝乳酶的热失活可能存在中间过渡产物。

关键词：凝乳酶；热失活动力学；热稳定性

中图分类号：S879.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0110-04

Abstract To study the thermal deactivation kinetics behavior of rennin， the Arrhenius equation was used to obtain the deactivating rate constant （k） and half-life （t1/2） at different temperatures （334～343 K）. Then， the activation energy （Ea） of deactivated rennin was obtained， which was （539.58±1.55） kJ/mol. When the temperature was in the range of 335～343 K， the deactivating rate constants could be well fitted with linear regression， which suggested that the deactivation of rennin was in accordance with the first-order kinetics model. At the lower temperature of 334 K， the curve of deactivating rate constant had lower linear fitting degree. The deactivating rate constant was on the high side at earlier stage but on the low side at later stage of heat preservation， and the curve slope was significantly different between earlier and later stages， which indicated that transition-state intermediate might be existent in the deactivation process of rennin.

Keywords Rennin； Thermal deactivation kinetics； Thermostability

凝乳酶是从小牛皱胃中发现的一种酸性天门冬氨酸蛋白酶，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽键，产物之一的副κ-酪蛋白凝结成网状结构，并在Ca2+存在的情况下使牛奶凝结[1]。凝乳酶是制作乳酪必需的酶制剂，但必须在凝乳完成后进行加热灭活，以尽量降低凝乳酶的蛋白酶活力，否则会使乳酪出现苦味和质构缺陷[2，3]。

小牛皱胃凝乳酶一直是乳酪生产所用的酶制剂，但其产量有限。因此，研究者分别从动物、植物、微生物中[4-6]，以及利用基因重组等方法寻找凝乳酶的低成本替代品。不同来源的凝乳酶热稳定性有一定差别，Mohanty等[4]从水牛胃中提取到的凝乳酶热稳定性高于小牛凝乳酶。本课题组以毕赤酵母表达的微小毛霉凝乳酶在55℃保温20 min就会完全失活[7]。为了深入研究凝乳酶耐热性的差异，以及为乳酪生产提供指导，有必要准确测定凝乳酶的热稳定性。

失活动力学是研究酶热稳定性的经典方法[8]，热失活动力学参数（热失活速率常数、半衰期以及失活活化能等）能够更准确、更直观地反映酶的热稳定性，常用于不同状态下酶热稳定性的比较。如：Gouda等[9]研究了葡萄糖氧化酶的热失活作用，以及不同无机盐提高其热稳定性的机理。刘晶萍等[10]采用失活动力学方法比较了果胶酶在溶液中和棉织物上的热稳定性。李君兰等[11]测定了鲜枣脂氧合酶的热失活动力学参数，并与甜玉米进行了对比。张东浩等[12]在失活动力学研究的基础上，详细研究了海藻糖对脂肪酶的保护机理。本研究通过测定334～343 K条件下凝乳酶活力随时间的变化情况，并根据Arrhenius方程计算得到凝乳酶的热失活动力学参数，以便用作与其他来源凝乳酶热稳定性的比较，同时为乳酪生产过程中凝乳酶灭活工艺的确定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凝乳酶购自Sigma公司；脱脂奶粉购自伊利实业有限公司；其他试剂均为分析纯；水为二次去离子水。

1.2 试验方法

1.2.1 凝乳酶活力测定 凝乳酶活力测定采用Arima法[13]：凝乳酶用0.02 mol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液稀释800倍，凝乳时间为40 s，将其作为初始酶液。取初始酶液0.5 mL，35℃预热5 min后加入到5 mL 35℃预热的pH 6.0、含1%CaCl2的10%脱脂牛乳中，计时至管壁出现颗粒，记录凝乳时间（t）。以35℃ 40 min凝乳1 mL的酶量为1个酶活力单位（1 U）。其活力计算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×t×n 。 （1）endprint

式中：A为凝乳酶活力，U；t为凝乳时间，s；n为稀释倍数，本试验为1。

1.2.2 凝乳酶热失活测定 1.5 mL离心管中加入0.6 mL凝乳酶液，放入水浴锅中立即开始计时，水浴完成后立即转入冰水中快速降温至0℃，然后取0.5 mL酶液测酶活。

2 结果与分析

2.1 凝乳酶活力测定的标准曲线

前期试验结果表明，凝乳时间>40 s时，凝乳酶浓度与酶活力线性关系较好。将初始酶液继续稀释，使凝乳时间在40～600 s。以凝乳酶活力对初始酶液浓度作图，得到凝乳酶活力标准曲线A=601.7X+9.658（R2=0.9990）（图1）。

2.2 凝乳酶相对酶活的测定

凝乳酶在不同温度保温一定时间后残余相对活力的计算公式为：

Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中：Ar为保温一定时间后凝乳酶残余的相对酶活，%；Ap为保温一定时间后凝乳酶的残余活力，U；A0为未经保温的凝乳酶活力，U。

凝乳酶活力随保温时间的延长而逐渐降低，温度越高酶的失活速度越快。334 K保温360 min，凝乳酶活力仍保留36.9%；而343 K保温8 min已检测不到酶活力（图2）。

2.3 凝乳酶热失活动力学参数的计算

在热失活动力学研究中，热失活速率常数（k）、失活半衰期（t1/2）和失活活化能（Ea）是表征酶热稳定性的三个重要参数。不同温度下的失活速率和半衰期反映生物酶失活快慢，热失活活化能反映酶热稳定性强弱。

当凝乳酶的失活遵循一级反应动力学时，则：

lnAr对保温时间t作图，结果如图3所示。线性回归的斜率即为热失活速率常数的相反数（-k）。

凝乳酶半衰期的计算公式为：

根据（4）和（5）得到凝乳酶在不同温度的热失活速率常数k、线性回归的相关系数R2以及半衰期t1/2（表1）。其中，335～343 K的线性回归拟合结果较好，符合一级反应动力学规律。在较低的334 K拟合度不佳，其失活速率常数曲线，在90 min前后分为斜率不同的两段，这表明凝乳酶在334 K的失活不符合一步失活反应动力学规律。因此，在计算失活活化能时，不将该点计算在内。

式中，T為反应的绝对温度，K；Ea为失活活化能，J/mol；R为气体常数。以lnk对1/T作图，通过直线的斜率可计算得到失活活化能Ea为（539.58±1.55） kJ/mol。

3 讨论与结论

蛋白分子中的氢键、二硫键、疏水作用、分子间作用等作用力维持着蛋白质的三维结构。酶的热失活过程主要原因是由于分子热运动加剧，酶分子的结构或者构象被破坏，蛋白质链松散化，二级、三级结构打开，导致了酶催化功能的丧失[14]。凝乳酶在334～343 K的失活速率差异极大，在334 K保温360 min凝乳酶活力仍可保留36.9%；而在343 K保温8 min，已检测不到酶活力。以相对酶活的对数lnAr对保温时间t作图，335～343 K线性回归拟合较好，说明在该温度范围内，凝乳酶的热失活符合一级反应动力学规律，其斜率即为热失活速率常数的相反数（-k）。在此基础上，根据Arrhenius方程，计算得到了凝乳酶的失活活化能Ea为（539.58±1.55） kJ/mol。

然而，该方法仅适用于较高温度下凝乳酶热失活性质的表征。在335 K凝乳酶热失活速率常数曲线的拟合度有所降低，而334 K线性回归相关指数只有0.8325，该曲线分成了斜率不同的两段。根据张东浩等[12]采用的二步失活动力学模型拟合不符合一步失活动力学模型的数据，取得了较好的结果，其模型如下：

Ek1E1k2E2

该模型能够较好地解释334 K凝乳酶的热失活速率常数曲线拟合的结果，提示凝乳酶的热失活可能存在中间过渡产物。根据二步失活动力学模型，分子热运动能部分破坏凝乳酶分子的三级结构，使凝乳酶由初始状态E，转变为仍可保持一定催化功能但催化效率下降的E1。在较高温度下，分子热运动十分剧烈，使凝乳酶分子内外界面基团和水分子形成的氢键和其他次级键快速断裂，E1催化活力也快速丧失，此时k2>>k1，中间产物E1对酶活力的影响较小。当温度较低时，k2

参 考 文 献：

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