枣实蝇mtDNA COI基因片段克隆技术研究

程晓甜,阿地力·沙塔尔,张伟，朱万友

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052;2.昌吉州林业有害生物防治检疫局，新疆 昌吉 831100；3.新疆出入境检验检疫局技术中心,新疆 乌鲁木齐 830083)

枣实蝇(CarpomyavesuvianaCosta)是全国林业检疫性有害生物，是一种十分危险的新入侵的害虫。2007年，首次在新疆吐鲁番地区发现的重大检疫性害虫，系在新疆乃至全国枣产业上有着重要经济意义的害虫。在2007年5月29日发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中把枣实蝇列为我国禁止进境的检疫性入侵害虫(中华人民共和国农业部公告，2007)[1-4]。枣实蝇属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)实蝇亚科(Trypetinae)实蝇族(Trypetini)咔实蝇属(CarpomyaCosta)。随着中国经济的高速发展，国内地区间和国际的商业贸易与人员往来日渐频繁，造成枣实蝇的扩散概率越来越高。然而枣实蝇一旦入侵新的区域，往往会给入侵地的枣产业带来严重的后果，甚至是毁灭性的打击。因此，在枣产业安全与植物检疫中枣实蝇的检疫鉴定愈来愈重要[5,6]。

本研究首次利用DNA克隆技术，将枣实蝇mtDNA COI基因以菌液形式长期保存，当需要时可以取出培养提取质粒，解决了在口岸实蝇鉴定中国外获取标本困难，或缺乏阳性对照的难题，为枣实蝇快速鉴定提供了材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枣实蝇蛹标本分别采自4个地区：吐鲁番市、KSS、HSX和HMS，其采集地，个体数量及采集时间见表1。

表1 不同枣实蝇种群的标本采集地点、 个体数量以及采集时间

1.2 试验方法

1.2.1 目标片段常规PCR扩增 枣实蝇mtDNA COI基因目标片段用引物Uea7和Uea10进行PCR扩增获得，PCR反应体系：PCR扩增在定量梯度PCR仪上进行，反应体系： 10×Buffer2.5 μl，Mg2+2 μl，dNTP 2.5 μl，上下游引物各0.2 μl，1 UTaq酶(Takara)0.2 μl，模板DNA2.5 μl，加水至总体积25 μl。

PCR扩增条件：94 ℃/5 min，95 ℃/40 sec，48 ℃/30 sec，72 ℃/1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30 min(90 V)，在数字图像分析仪上检测结果[6-8]。

1.2.2 PCR产物纯化 将50μl左右的DNA样品用含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30 min(90V)电泳分离，电泳缓冲体系为TBE。回收DNA(片段大约为700 bp)；采用宝生物工程(大连)有限公司生产的Takara Agarose Gel DNA Purfication Kit Ver.2.0 code DV805A纯化目的条带。回收DNA溶于25 μlElution Buffer中。

1.2.3 载体连接 将纯化的PCR产物与pGM-T 载体 (大连宝生物公司)连接，操作按说明书进行，其中目的PCR片段7 μl， pGM-T 载体1 μl，10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl， T4 DNA Ligase (3 U/μl) 1 μl ，16 ℃过夜连接。

1.2.4 转化 将5 μl连接液加入到50 μl新鲜制备的感受态细胞进行转化；将细菌涂布在90 mm平板上，在制平板之前1 LLB培养基中加100 μlIPTG(50 mg·mL-1)和200 μl 20 mg·mL-1X -gal，细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整；平板在37℃下正向放置半小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

1.3 检测

1.3.1 常规检测 重组克隆筛选一蓝/白斑筛选，当外源DNA片段插入到pGM-T中后，由于外源DNA的核酸序列在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β一半乳糖苷酶ɑ片段的活性，因此重组克隆X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色[7]。

从平板中挑4个白斑克隆，置于4 mL LB-AMP培养基中，37 ℃，150 rpm过夜培养。采用宝生物工程(大连)有限公司生产的TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提质粒，用Elution Buffer中溶解DNA， PCR法进行阳性克隆的筛选。采用的引物用UEA7和UEA10， PCR产物约700 bp。与克隆前PCR产物的大小一致，确定为阳性克隆。

1.3.2 酶切反应 在10 μL 反应体系中加入5 μL 质粒， 酶ECORI 1 μL， 10×buffer1 μL ， 最后加ddH2O至10 μL ，将上述混合液置37 ℃水浴4 h。

1.3.3 快速检测 挑取白色菌落直接进行PCR检测。

1.3.4 测序鉴定 使用常规检测或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。

2 结果与分析

2.1 枣实蝇mtDNA COI基因片段克隆

本研究对四个地区枣实蝇的线粒体DNA细胞色素氧化酶I(COI)从M7至COOH之间约700 bp片段部分序列进行克隆，分别获得克隆片段的菌液和质粒，菌液和质粒均保存于-20 ℃。

2.2 DNA克隆片段常规PCR检测

用四个地区枣实蝇的DNA克隆片段的质粒直接作为模板，用引物Uea7和Uea10进行常规PCR检测，以检查克隆片段的大小，检测结果如图所示：可以看出500～750 bp之间大约700 bp目标片段的位置有一条扩增带，亮度差异表示模板浓度的差异。DNA确切浓度和纯度通过核酸蛋白检测仪来测定。见图1。

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX枣实蝇，2: HMS枣实蝇, 3：吐鲁番市枣实蝇，4：KSS枣实蝇图1 Uea7/ Uea10 引物 PCR 模板 DNA 质量电泳图

2.3 酶切反应

用酶ECORI进行酶切反应，取酶切产物5 μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶上电泳30 min(90 V)，结果如图2所示：

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX枣实蝇，2: HMS枣实蝇, 3：吐鲁番市枣实蝇，4：KSS枣实蝇图2 酶切电泳图

3 讨论

在枣实蝇快速鉴定上枣实蝇克隆片段具有很大的应用价值，在对未知的实蝇标本任何虫态(无论是成虫还是卵、幼虫、蛹)在进行快速鉴定时，阳性对照可用枣实蝇的COI基因克隆质粒，而含枣实蝇mtDNA COI基因的菌液可以长期保存，当需要时可以取出培养提取质粒。这样就解决了在口岸实蝇鉴定中国外获取标本困难、或是缺乏阳性对照的难题，同时也为能够进行大规模的SYBR Green PCR实时荧光检测提供了充足的实验材料[6-9]。

[1] 程晓甜,阿地力·沙塔尔,张伟,等.枣实蝇四个地理种群的线粒体Cytb基因序列分析[J].林业科学,2014,50(3):144-150

[2] 程晓甜,阿地力·沙塔尔,张伟，等.枣实蝇特异引物PCR鉴定技术[J].林业科学,2013,49(11):98-102

[3] 程晓甜,阿地力·沙塔尔,张伟,等.枣实蝇及相关5种检疫性实蝇PCR-RFLP快速鉴定技术[J].南京林业大学,2014,38(1):183-185

[4] 程晓甜,阿地力·沙塔尔,张伟,等.SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇技术[J].林业科学,2014,50(4):60-65

[5] 阿地力·沙塔尔,张伟,程晓甜,等.枣实蝇不同地理种群亲缘关系研究[J].林业科学，2012,48(6):136-140

[6] 余道坚.检疫性实蝇分子生物学快速鉴定技术的研究[D].北京:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院),2005

[7] 申建梅,胡黎明,宾淑英,等.瓜实蝇嗅觉受体基因的克隆及表达谱分析[J].昆虫学报,2011,54(3):265-271

[8] 申建梅,胡黎明,宾淑英,等.瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达[J].华中农业大学学报,2011,30(4):455-460

[9] Jamnonglik W,Baimai V，Kittayapong P. Molecular evolut -ion of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica,2003,119(1):19-25