敌敌畏对斑马鱼急性毒性试验

胡秀彩 杨小平 吕爱军⋆ 孙敬锋

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室 天津 300384）（2.江苏师范大学生命科学学院 江苏 徐州 221116）

敌敌畏对斑马鱼急性毒性试验

胡秀彩1杨小平2吕爱军1⋆孙敬锋1

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室 天津 300384）（2.江苏师范大学生命科学学院 江苏 徐州 221116）

为探究农药对斑马鱼的毒性与安全评价，选用在农业害虫防治中广泛使用的有机磷农药敌敌畏进行急性毒性试验，以24～96h半致死浓度（LC50）判断斑马鱼对敌敌畏的敏感性。结果表明，敌敌畏24h LC50、48h LC50、72h LC50、96h LC50分别为66.189mg/L、46.647mg/L、35.836mg/L、33.764mg/L，安全质量浓度（SC）为6.95mg/L。参照我国化学物质对鱼类毒性分级标准，判定敌敌畏对斑马鱼急性毒性为Ⅲ级，根据《化学农药环境安全评价试验准则》对鱼类毒性等级划分，可判定敌敌畏对斑马鱼为低毒农药。

斑马鱼；敌敌畏；急性毒性；半致死浓度；安全质量浓度

斑马鱼（Brachydanio rerio）是最早生活在印度和南亚的一种热带鱼，目前已经成为遗传学和毒理学研究的重要模式生物，其具有发育快、易于实验室饲养、繁殖量大、周期短、胚胎透明以及易于实验操作等优点。斑马鱼作为一种生态毒理学实验模式动物，除了具有经济、观赏价值外，目前已成为研究脊椎动物胚胎发育及对外界环境变化，如紫外线、重金属盐类、农药、消毒液、工业污水、放射性物质等的良好的研究材料。近年来，我国农业得到了迅猛的发展，特别是南方地区出现了水产养殖与稻田耕作有效结合的科学养殖方式（水产养殖与稻田紧密相邻、稻田-鱼塘水相互交错使用），直接向水体施药或农田施用的农药随地表和地下径流等途径进入水体等情况，使得化学农药的大量施用对水产养殖业，乃至生态环境带来了严重的影响。我国目前农药年产量达80万吨，居世界第二位，而敌敌畏因其具有杀虫谱广，廉价易得，对人和高等动物低毒等特性，现已成为使用最为广泛的有机磷农药之一。

敌敌畏又名DDVP，学名O,O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，属于有机磷农药，具有很高的水溶性，用在农业害虫和卫生害虫防治上。近年来，随着水质环境的恶化和水产养殖业的发展，鱼类急性毒性研究备受关注，但多用鲤鱼、金鱼、草鱼等作为试验对象。斑马鱼急性毒性试验作为检测工业污染及水体污染的重要手段之一，目前还未广泛采用。而在敌敌畏的急性毒性研究中，两栖类的研究成果较丰富，鱼虾的研究较少，蚯蚓等土壤生物偶有报道。本实验采用农业生产中最普遍使用的农药敌敌畏对斑马鱼进行急性毒性试验，获得了敌敌畏对斑马鱼的基础毒理学数据，为渔业生产提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

斑马鱼（平均体长3.9cm，平均体重0.44g）：购于徐州市某花鸟市场；敌敌畏（有效成分含量77.5%，350g剂型乳油）购自湖北沙隆达股份有限公司，现配现用。试验前在实验室驯养5d以上，试验前一天停止喂食，试验期间也不喂食。试验在容积为1L的玻璃烧杯中进行，每组随机放10尾鱼。试验用水为经曝气48h以上去除余氯后的蒸馏水，试验期间保持充气。培养箱温度为25±2℃。光照/黑暗为12h/12h。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验

参照吕爱军等试验方法进行，采用静水法进行急性毒性试验。以有效成分含量为77.5%的敌敌畏配制7个不同浓度的试剂系列，并且设一个空白对照，每个浓度及对照组随机放入10尾试验鱼。试验开始连续观察8h，观察记录鱼的中毒情况（平衡、游动、反应、呼吸、体色变化）以及96h内的死亡情况及开始死亡时间和死亡数目。当鱼死亡时，及时捞出，以免污染水质，观察并记录其体表特征和内脏表面特征。试验时间为96h，96h后若仍有活鱼，继续试验至7d。

1.2.2 数据处理

采用Bliss法计算斑马鱼的半致死浓度LC50，安全质量浓度SC用公式SC=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）2计算。死亡率=死亡试验鱼数/试验鱼总数×100%。

2 结果

2.1 斑马鱼急性毒性试验结果

敌敌畏对斑马鱼急性毒性试验结果表明：敌敌畏质量浓度达到60 mg/L以上时，24h内试验鱼出现死亡，48h内全部死亡；敌敌畏的质量浓度为80 mg/L时，2h后个别鱼即出现侧翻，7h后在底挣扎、腹部朝上、严重失衡，12h后完全丧失活动能力，张口喘气，15h开始出现死亡、30h全部死亡，其中15-24h为试验鱼集中死亡时段；敌敌畏质量浓度达到50mg/L以上，试验鱼在72h内全部死亡。敌敌畏质量浓度低于30mg/L时，7d后仍有存活鱼。试验鱼7d时的死亡率相比96h，30mg/L和40mg/L试验鱼的死亡率有所提高。当敌敌畏质量浓度为10mg/L，没有出现鱼死亡，说明此浓度敌敌畏对斑马鱼的毒性作用较小。

2.2 斑马鱼中毒表现及死亡特征

敌敌畏对斑马鱼中毒较慢，斑马鱼刚放入水中时出现急速蹿游现象，但很快消失，稍后鱼群安静地沉于水底。适应环境后，鱼较多游动，偶有集群现象，既而出现上浮、顶水、尾略下垂、安静浮于水面现象。随着中毒程度加深，试验鱼出现颤抖、失衡现象，或沉于水底，或侧翻浮于水中部，或弓背、头朝上、尾朝下立于水中，腹鳍摆动不平衡及展开不全，游动能力减弱甚至丧失，反应迟钝、呼吸频率加快、张口喘气、鳃盖外掀，最后腮部出血死亡，或侧躺沉于水底，或腹部朝上浮于水面，部分鱼死亡时嘴、胸鳍张开，出现明显折弯现象，体色加深(见图1)。高质量浓度组试验鱼从受试、中毒到死亡的间隔时间短，中毒现象也更明显。

表1 敌敌畏对斑马鱼的LC50和SC

图1 斑马鱼中毒特征：鱼腮部出血、胸鳍展开（上）、侧折弯现象（下）

2.3 LC50值及质量安全浓度（SC）

经过统计学分析，敌敌畏的半致死浓度及质量安全浓度值见表1。结果表明，敌敌畏的安全质量浓度为6.95mg/L。参照我国化学物质对鱼类毒性分级标准GB/T 21281-2007(96h LC50≤1.0mg/L时为急性毒性Ⅰ级，1.0mg/L≤96h LC50≤10.0mg/L为急性毒性Ⅱ级，10.0mg/L≤96h LC50≤100.0mg/L为急性毒性Ⅲ级)。敌敌畏的96h LC50为33.764mg/L，由此判定敌敌畏对斑马鱼的急性毒性为Ⅲ级。根据《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性等级划分（剧毒，96h LC50≤0.1mg/L；高毒，96h LC50≤1.0mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96h LC50≤10.0mg/L；低毒，96h LC50＞10.0mg/L），可判定敌敌畏对斑马鱼为低毒农药。

3 讨论

近年来，针对敌敌畏的急性毒性试验研究，在蛙、蟾蜍等两栖类报道较多，在鱼、虾等研究较少。斑马鱼急性毒性试验作为检测工业污染及水体污染的重要手段之一，目前鲜有报道。本研究采用农业生产中最普遍使用的有机磷农药敌敌畏对斑马鱼进行急性毒性试验，以期为农业生产、水产养殖及鱼病防治等方面提供一定的参考依据。在本试验中，敌敌畏对斑马鱼的安全质量浓度为6.95 mg/L，与韩庆莉等报道敌敌畏对鲫鱼幼鱼48h、72h和96h的LC50分别为45.1 mg/L、30.4mg/L和23.3mg/L，安全质量浓度为2.3mg/L，与黄周英等报道敌敌畏对金鱼24h、48h、72h和96h的 LC50分别为39.17mg/L、33.65mg/L、27.10mg/L和25.94mg/L，安全质量浓度为2.594 mg/L相差较大，说明不同鱼类对药物的敏感性不同。姚庆祯等通过敌敌畏对南美白对虾幼虾的急性致毒研究发现，敌敌畏对南美白对虾幼虾24h、48h、72h和96h的LC50分别为44.0×10ˉ3mg/L、37.8×10ˉ3mg/L、10.0×10ˉ3mg/L和7.6×10ˉ3mg/L，安全质量浓度为7.6×10ˉ4mg/L，说明虾类对环境变化较敏感，敌敌畏对虾类的毒性较强。在敌敌畏的急性毒性研究成果较丰富的两栖类领域，何海艳等采用常规方法研究了敌敌畏对云南小狭口蛙蝌蚪的急性毒性影响，结果表明敌敌畏对小狭口蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分别为114.82mg/L、102.33mg/L、81.28mg/L和51.29mg/L。耿宝荣等指出敌敌畏对黑眶蟾蜍蝌蚪96h的LC50为51.61mg/L。以上数据表明敌敌畏对两栖类的毒性相比较斑马鱼要低一些，但王健鑫等则报道敌敌畏对中国林蛙蝌蚪的安全质量浓度为1.86 mg/L。耿宝荣等对沼蛙蝌蚪进行了敌敌畏的急性毒性试验，表明敌敌畏对沼蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分别为9.104mg/L、8.064mg/L、6.304mg/L和5.680mg/L。薛清清等通过敌敌畏的急性毒性试验测得敌敌畏对纹饰姬蛙蝌蚪24h和48h的LC50为3.91mg/L和1.97mg/L，安全质量浓度为0.15mg/L。以上数据中，敌敌畏对两栖类的毒性又明显高于斑马鱼，以此说明两栖类中不同品种的蛙类对敌敌畏的耐受性存在着显著的差异。另外，胡霞等在敌敌畏的急性毒性研究中，涉及到了对蚯蚓的毒性，结果显示，用滤纸接触法测得敌敌畏对蚯蚓的LD50为0.14g/L，自然土壤法测得敌敌畏对蚯蚓的LD50为1.11g/L。

有机磷农药主要通过干扰生物神经系统功能对水生生物产生毒害作用。敌敌畏属神经毒剂，其作用机制是通过它与掌管神经正常冲动传递的胆碱酯酶结合，将胆碱酯酶的活力点磷酸化，使胆碱酯酶活力受抑，失去水解乙酰胆碱的能力，从而使动物神经传导失常，中毒死亡。本实验中敌敌畏暴露组斑马鱼表现出的急躁不安等症状是神经系统中毒的表现。杨先乐等出水生动物处于低浓度的有机磷中也会发生慢性中毒，临床主要表现为水生动物普遍表现为食欲减退，呼吸困难，食物转化率下降，随着新陈代谢水平的降低，生长减缓，甚至停止；有机磷农药能引起孵化率下降，对胚胎有致畸作用，可使幼体形体弯曲，身体瘦弱，眼睛色素沉淀，失去平衡，行为反常，身体上长出水泡，心包囊扩大，血液循环受阻；有机磷能抑制各组织中的胆碱酯酶活性，也可引起血红素水平下降，红细胞数量下降，红细胞比容降低，血浆脂类总蛋白和碳氢化合物含量降低；当有机磷农药被摄人后，对肝脏、胰脏、鳃、肠、肌肉等实质性脏器存在毒性效应；严重时使这些组织的细胞坏死、破裂，致使其中的RNA和DNA含量降低；在生物体内的累积效应。此外，各种环境的理化因素，鱼类的种类、大小、生长条件以及它们的适应能力，水体的硬度、pH值、盐度、有机物、悬浮物、水温、溶解氧等都会对鱼的死亡率产生影响，这些条件的稍微变化，都会对鱼病防治效果产生影响。斑马鱼对环境的变化比较敏感，故以斑马鱼为试验对象测出的安全质量浓度数据在渔业生产中比较保守，可以放心参考。

本研究结果表明敌敌畏对斑马鱼的急性毒性为Ⅲ级，对斑马鱼的毒性等级为低毒。敌敌畏的安全质量浓度为6.95 mg/L，是渔业生产中常用质量浓度的7-17倍，因而敌敌畏对斑马鱼的毒性较小，提示是斑马鱼的安全药物用。

（略）

天津市自然科学基金重点项目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000)；国家自然科学基金(31272692)；天津市水产产业技术体系创新团队（ITTFRS2017009）

胡秀彩，1976年生，女，江苏徐州人，实验师，主要从事水产微生物学研究，E-mail:huxiucai@126.com。

吕爱军，教授，主要从事水产动物疾病与防治方面研究，E-mail:lajand@126.com