产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对巨噬细胞作用比较

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1．辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2．辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600

产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对巨噬细胞作用比较

吴琦1张凡2鞠成国1,2*贾天柱1,2

1．辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2．辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600

目的比较产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对巨噬细胞的作用差别，探讨产地加工一体化黄柏饮片的优势。方法分别以不同浓度产地加工一体化和传统加工黄柏饮片的生品及其盐制品药液作用于小鼠巨噬细胞，4 h后加入脂多糖刺激，培养24 h后测定上清液中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量，并观察巨噬细胞对中性红吞噬能力的变化。结果同剂量各组与传统加工的生黄柏饮片组相比，黄柏盐炙品以及产地加工一体化黄柏组的TNF-α、IL-6、IL-10和NO水平显著性(P<0.05)或极显著性降低(P<0.01)，吞噬能力增强。结论产地加工一体化黄柏饮片能明显降低炎症因子水平，增加巨噬细胞对中性红的吞噬能力。

产地加工一体化；巨噬细胞；脂多糖；吞噬

黄柏味苦、性寒，为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”，具有清热燥湿、解毒疗疮、泻火除蒸的功效[1]。目前已有大量关于川黄柏的化学成分研究，其化学成分主要包含生物碱类、酚酸类、黄酮类以及少量柠檬苦素类化合物[2-3]。现代药理研究均表明，黄柏具有解热、抗炎抗菌、抗溃疡、降血糖、祛痰镇咳、抗癌和抗血小板聚集等作用，且对免疫系统和心血管也有一定影响，这与其所含化学成分有着十分密切的关系[4]。

黄柏的传统加工方法是取干黄柏药材，用水闷润软化后再切制成黄柏丝干燥。这种加工方法会使黄柏药材在闷润软化过程中有效成分大量流失，导致黄柏的药理药效有所下降。而根据文献记载[5-10]，药材采用产地加工一体化的加工方法，可有效降低化学成分损失，提高药效。巨噬细胞是最重要的免疫细胞之一[11]，实验对黄柏药材采用产地加工一体化的加工方法，考察产地加工一体化黄柏与传统方法加工的黄柏对巨噬细胞的分泌和吞噬功能的影响，找到产地加工一体化黄柏在抗炎药效方面的优势，为黄柏饮片的质量评价提供实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器 双人单面超净工作台(上海智成科学仪器有限公司)，CO2培养箱(日本三洋MCO-15AC), METTLERAE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER),酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)，TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，倒置显微镜(宁波永新NIB-100)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯科学仪器有限公司)，-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔医疗设备股份有限公司)，微量移液器(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)，电子天平(上海瑶新电子科技有限公司)，涡旋混合器(上海青浦沪西仪器厂)。

1.2 药物与试剂 黄柏药材采自四川省荥经县，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。小鼠巨噬细胞株(货号：RAW264.7，中国科学院上海细胞库)，DMEM高糖培养基(Thermo公司)，新生胎牛血清(Thermo公司)，双抗(青霉素和链霉素，Gibco公司)，胰酶(Reanta公司)，PBS(Solarbio公司)，75%医用消毒酒精，CCK-8试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，小鼠肿瘤坏死因子-α试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司，批号：BPE20220)，小鼠白细胞介素-6试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司，批号：BPE20012)，小鼠一氧化氮试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司，批号：BPE20293)，小鼠白细胞介素-10试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司，批号：BPE20005)，水为纯净水，其余试剂为分析纯。

1.3 黄柏饮片的制备 传统生黄柏丝：取干燥的黄柏树皮，用水闷润软化，切制成2～4 mm后干燥。

传统盐黄柏丝：取大小均一的传统加工的生黄柏丝放入容器中，喷入盐水，拌匀，密闭闷润2h后取出，在150～160 ℃条件下，置锅中炒5min，取出放凉，即得。每100 kg黄柏用盐2 kg，30 L水溶解盐。

产地加工生黄柏丝：采集黄柏树皮，趁鲜切制成2～4 mm后干燥。

产地加工盐黄柏丝：取大小均一的产地加工的生黄柏丝放入容器中，喷入盐水，拌匀，密闭闷润2h后取出，在150～160 ℃条件下，置锅中炒5min，取出放凉，即得。每100 kg黄柏用盐2 kg，30 L水溶解盐。

2 实验方法

2.1 脂多糖(LPS)的配制 精密称取5 mg脂多糖粉末，用经微孔滤膜过滤除菌的高糖培养基DMEM溶解，定容至5 mL，得浓度为1 mg/mL的脂多糖原液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后待用，于冰箱-4 ℃保存备用。

2.2 0.1%中性红的配制 精密称取0.03 g中性红粉末，用已过滤除菌的PBS溶解，定容至30 mL，得浓度为0.1%的中性红溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后待用，于冰箱-4 ℃保存备用。

2.3 供试药物溶液的配制 精密称取传统生黄柏、传统盐黄柏、一体化生黄柏、一体化盐黄柏各8 g，加入80 mL水回流提取1h，取出药液，再加入80 mL水回流提取1h后取出药液，合并两次药液后过滤，将滤液中的水分蒸干并冻干成粉，用DMEM溶解冻干粉，配制成含生药浓度为100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的药液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后于冰箱-20 ℃保存备用。

2.4 培养基的配制 取84 mL的DMEM高糖培养基，15 mL胎牛血清，1 mL双抗混合，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

2.5 RAW264.7细胞的培养和传代 RAW264.7细胞株购自中国科学院上海细胞培养中心，细胞购回后，用75%酒精棉擦拭细胞培养瓶表面，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中适应性培养，24h后取出，显微镜下观察细胞密度大约80%以上，细胞形态大多为梭形且贴壁牢固，则开始传代。

传代开始时，从培养箱中取出细胞培养瓶，用移液枪吸弃瓶内培养基，加入2 mL无菌、常温PBS缓慢清洗两次，以清除残余培养基和生长状态不好的未贴壁细胞。然后加入2 mL胰酶，放CO2培养箱内消化3 min，在显微镜下观察大部分细胞回缩，但无脱落为宜，加入3 mL “2.4”项下配制的含血清培养基终止消化，用移液枪将细胞培养瓶内壁上的细胞都冲洗下来，转入离心管内离心5min，取出弃去离心管内液体，加5 mL含血清培养基，用吸管反复吹打将细胞打散，然后取10 μL细胞悬液于显微镜下计数，用含血清培养基调整细胞浓度，以1∶2～1∶3的细胞含量比例传代，一般传代时间为2～3d，传到第三代后，采用处于对数生长期的生长状态良好的细胞进行实验。传代前和传代后的细胞见图1。

2.6 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞增殖率的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞经胰酶消化、细胞刮刮取、培养基内吹打后，用含血清培养基将细胞密度调整为1.7×106/mL，接种到96孔板上，每孔100 μL细胞悬液，另留出3个孔不加细胞悬液，加无血清培养基100 μL作为空白对照组。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃去含血清培养液，加入100 μL无血清的DMEM培养基，饥饿细胞12h，使细胞周期同步化。弃去无血清培养基，给药组加入浓度为100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的传统加工生黄柏，传统加工盐黄柏，产地加工一体化生黄柏，产地加工一体化盐黄柏药液100 μL，空白组加入无血清DMEM培养基100μL，每组重复做6个复孔。药物作用4 h后，除空白组外，每组加入终浓度为2.5 μg/mL的脂多糖100 μL刺激。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养20 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，于培养箱中继续培养2h，在酶标仪450 nm处测定OD值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=OD实验组均值/OD对照组均值×100%。

2.7 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞经胰酶消化、细胞刮刮取、培养基内吹打后，用含血清培养基将细胞密度调整为1.3×106/mL，接种到96孔板上，每孔100 μL细胞悬液。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃去含血清培养液，加入100 μL无血清的DMEM培养基，饥饿细胞12h，使细胞周期同步化。弃去无血清培养基，分组，空白对照组：加入200 μL无血清DMEM培养基，模型对照组：加入100 μL终浓度为2.5 μg/mL的脂多糖和100 μL无血清DMEM培养基，给药组：加入浓度为100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的传统加工生黄柏，传统加工盐黄柏，产地加工一体化生黄柏，产地加工一体化盐黄柏药液100 μL和终浓度为2.5 μg/mL的脂多糖100 μL，终体积为200 μL，每组重复做6个复孔。置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃培养上清液，加入0.1%中性红溶液200 μL，在培养箱内孵育60min，弃中性红，用预温的PBS洗3遍，每次200 μL，甩干。每孔加入200 μL细胞溶解液醋酸-无水乙醇(1∶1)，4 ℃静置过夜，酶标仪540 nm处测OD值，并计算细胞相对吞噬率。细胞相对吞噬率(%)=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

2.8 ELISA法测定RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量 取4瓶处于对数生长期的RAW264.7细胞经胰酶消化、细胞刮刮取、培养基内吹打后，分别用含血清培养基将细胞密度调整为1.7×106/mL、1.3×106/mL、1.2×106/mL、1.2×106/mL，分别接种到96孔板上，每孔100 μL细胞悬液。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃去含血清培养液，加入100 μL无血清的DMEM培养基，饥饿细胞12h，使细胞周期同步化。弃去无血清培养基，给药组加200、400、800 μg/mL的传统加工生黄柏，传统加工盐黄柏，产地加工一体化生黄柏，产地加工一体化盐黄柏药液100 μL，空白组和模型组加入无血清DMEM培养基100 μL，每组重复做6个复孔。药物作用4h后，除空白孔外，每组加入终浓度为2.5 μg/mL的脂多糖100 μL刺激。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，按照试剂盒说明书用ELISA法测定RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量。

3 结果与分析

3.1 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞增殖率的影响 从结果可知，随着给药浓度的增加，产地加工一体化与传统黄柏饮片的生、制品对RAW264.7细胞增值率的促进作用呈先上升后下降的趋势，在400 μg/mL时细胞的增殖率最高，800 μg/mL其次，说明最佳给药浓度为400 μg/mL。同剂量产地加工一体化生黄柏组与传统加工生品组比较，产地加工一体化生黄柏饮片组的细胞增殖率明显升高，同剂量产地加工一体化盐黄柏组与传统加工盐品组比较，产地加工一体化盐黄柏饮片组的细胞增殖率明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，促进细胞增长的作用更强。从图中也可看出产地加工一体化盐黄柏组细胞增殖率高于各给药组。详见表1、图2。

表1 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞增殖率的影响

续表1

表1 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞增殖率的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；同剂量一体化生品组与传统生品组比较，#P<0.05，##P<0.01；同剂量一体化盐品组与传统盐品组比较，aP<0.05，aaP<0.01。

3.2 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 从结果可知，空白组细胞的吞噬活性最强，与空白组相比，模型组的吞噬活性明显降低(P<0.01)，表明脂多糖造模成功。同剂量一体化加工生黄柏组与传统加工生品组比较以及同剂量一体化加工盐黄柏组与传统加工盐品组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)吞噬活性增强，表明产地加工一体化的黄柏和盐黄柏组细胞的吞噬活性强于传统加工的黄柏和盐黄柏组。详见表2。

表2 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞吞噬活性的影响

续表

表2 产地加工一体化与传统加工黄柏饮片对RAW264.7细胞吞噬活性的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；同剂量一体化生品组与传统生品组比较，aP<0.05，aaP<0.01；同剂量一体化盐品组与传统盐品组比较，bP<0.05，bbP<0.01。

3.3 ELISA法测定RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量 与空白组相比，模型组细胞上清液的TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明显升高(P<0.01)，说明脂多糖造模成功，使细胞发生炎症，造成炎症因子和细胞白介素增加。与模型组相比，各给药组细胞上清液的TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明显降低(P<0.05)，其中，传统加工盐炙品组和产地加工一体化生品组和盐炙品组含量明显降低(P<0.01)，抗炎效果较好。同剂量产地加工一体化生黄柏组与传统加工生品组比较，TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明显降低(P<0.05)，同剂量产地加工一体化盐黄柏组与传统加工盐品组比较，TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明显降低(P<0.05)，说明产地加工一体化黄柏饮片的抗炎效果更好，其中以产地加工一体化盐黄柏的抗炎效果最好，且给药浓度以400μg/mL为宜，800μg/mL其次。见表3。

表3 RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；同剂量一体化生品组与传统生品组比较，aP<0.05，aaP<0.01，同剂量一体化盐品组与传统盐品组比较，bP<0.05，bbP<0.01。

4 讨论

巨噬细胞是重要的免疫细胞之一，在机体先天性免疫系统中发挥着重要作用[12]。脂多糖不仅可以对靶细胞有直接损伤作用，而且可以通过信号转导将胞外刺激转入细胞核内，进而扩大并增强各种炎症因子的作用[13]。脂多糖可诱导炎症因子TNF-α和NO的产生，IL-6和IL-10是由多种免疫和非免疫细胞分泌的具有广泛生物学活性的细胞因子，在炎症反应发生时会大量分泌[14]。巨噬细胞表面有多糖的作用靶点，多糖能通过其活化巨噬细胞,进而影响巨噬细胞的吞噬功能[15]。从实验结果可知，与空白组相比，模型组细胞的增殖率和吞噬活性明显降低，炎症因子含量明显升高，给药组中炎症因子含量明显降低，其中以产地加工一体化黄柏饮片组的效果最好。同剂量产地加工生黄柏饮片组与传统加工生黄柏饮片组相比，其细胞增殖率和吞噬活性明显升高，炎症因子含量明显降低(P<0.05)，同剂量产地加工盐黄柏饮片组与传统加工盐黄柏饮片组相比，增值率和吞噬活性明显升高，炎症因子含量明显降低(P<0.05)，抗炎效果较好。

综上所述，产地加工一体化黄柏的抗炎作用优于传统加工黄柏，能明显降低巨噬细胞中炎症因子的含量，其中以产地加工一体化盐黄柏的效果最好，最佳给药浓度为400 μg/mL。

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ComparativetheEffectofOriginProcessingIntegrationandTraditionalPhellodendriChinensisCortexonMacrophages

WU Qi1ZHANG Fan2JU Chengguo1,2*JIA Tianzhu1,2

1.School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China；2.Liaoning Research Center of Traditional Chinese Medicine Processing Engineering, Dalian 116600, China

ObjectiveComparing the effect of origin processing integration and traditional Phellodendri Chinensis Cortex on macrophages, discuss the advantages of integrated processing of Phellodendri Chinensis Cortex.MethodsThe origin processing integration and traditional Phellodendri Chinensis Cortex and its processed with salt, we added them with different concentrations in the macrophages cells culture fluid, and then LPS was added after 4 hours, the contents of TNF-α, IL-6, IL-10 and NO in the supernatant were measured after culture of 24 hours, and observed the phagocytosis of macrophages to neutral red.ResultsThe same dose groups compared with the traditional Phellodendri Chinensis Cortex group, the levels of TNF-α, IL-6, IL-10 and NO were significantly decreased (P<0.05) or extremely significant decreased (P<0.01) in the Phellodendri Chinensis Cortex processed with salt and origin processing integration of Phellodendri Chinensis Cortex and enhanced phagocytosis.ConclusionThe integrated processing of Phellodendri Chinensis Cortex can significantly reduce the level of inflammatory factors and increase the phagocytic ability of macrophages to neutral red.

Origin Processing Integration; Macrophages; LPS; Phagocytosis

30种中药饮片产地加工与炮制生产一体化技术规范研究-黄柏(2015468002)。

吴琦(1992-)，女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药炮制工艺与原理研究。E-mail：1763165176@qq.com

鞠成国(1979-)，男，汉族，博士研究生，副教授，硕士生导师，研究方向为中药炮制原理研究。E-mail：jcg7092357@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)24-0026-06

2017-11-27 编辑：邓佳丽)