慢性自发性荨麻疹患者外周血Treg细胞比例和白细胞介素17A、27水平及意义

王亚婷 石春蕊 武奕 师蓓 熊潇 周兰霞

730000兰州大学第一临床医学院兰州大学第一医院皮肤性病科

慢性自发性荨麻疹患者外周血Treg细胞比例和白细胞介素17A、27水平及意义

王亚婷 石春蕊 武奕 师蓓 熊潇 周兰霞

730000兰州大学第一临床医学院兰州大学第一医院皮肤性病科

目的探讨外周血中CD4+CD25+CD127low调节性T（Treg）细胞、白细胞介素17A（IL⁃17A）和IL⁃27在慢性自发性荨麻疹发病机制中的作用。方法收集37例慢性自发性荨麻疹患者和40例健康对照外周血标本。采用流式细胞仪检测外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中IL⁃17A和IL⁃27水平。结果慢性自发性荨麻疹患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例（5.99%±2.72%）明显低于健康对照组（9.07%±3.44%，t=4.325，P＜ 0.01），IL⁃27水平［（20.54 ± 7.65）ng/L］亦低于健康对照组［（26.63± 9.72）ng/L，t=3.039，P=0.003］，IL⁃17A表达水平与健康对照组差异无统计学意义（P=0.529）。慢性自发性荨麻疹患者IL⁃17A表达水平与CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例呈负相关（r=-0.359，P=0.029），IL⁃17A、IL⁃27、CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例与UAS评分均无显著相关性（r值分别为-0.076、-0.083、-0.053，均P＞0.05）。结论慢性自发性荨麻疹患者外周血中可能存在Th17/Treg细胞失衡，且IL⁃27可能参与慢性自发性荨麻疹的发病过程。

荨麻疹；白细胞介素17；T淋巴细胞，调节性；白细胞介素27

研究表明，慢性自发性荨麻疹（chronic spontaneous urticaria，CSU）患者体内存在CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞间的失衡，可能是其发病的机制之一［1］。白细胞介素17A（IL⁃17A）是主要由Th17细胞分泌的一类促炎因子，参与自身免疫、炎症反应，起免疫监视作用。IL⁃27是对Th17/Treg细胞有调节作用的细胞因子，促进Treg细胞分化，阻止Th17细胞分化［2］。Th17/Treg细胞轴及其相关细胞因子在CSU中的调节机制尚不完全清楚，且IL⁃27在CSU病理过程中对Th17/Treg细胞轴的影响也不清楚。我们检测CSU患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例，测定IL⁃17A及IL⁃27表达，分析CD4+CD25+CD127lowTreg细胞、IL⁃17A 和IL⁃27之间的相关性，探讨其在CSU发病中的作用。

一、对象与方法

1.研究对象：CSU患者37例，来自2016年1-6月兰州大学第一医院皮肤科门诊，均符合CSU诊断标准［3］。其中男19例，女18例，年龄（40.41±15.33）岁，平均病程16.4个月（3个月至10年）。对照组40例，其中男21例，女19例，年龄（41.85±14.44）岁，均为本院健康体检者。两组受试者性别（P=0.551）及年龄（P=0.672）分布差异均无统计学意义。

2.试剂和仪器：人IL⁃17A ELISA试剂盒（编号GR213356⁃6）来自英国abcam公司，人IL⁃27 ELISA试剂盒来自武汉华美生物工程有限公司（编号：W23010221）。鼠抗人CD4异硫氰酸荧光素荧光抗体、CD25别藻蓝蛋白荧光抗体、CD127藻红蛋白荧光抗体均来自美国BD公司。全自动酶标仪（型号Victor2）产自芬兰珀金埃尔默公司。流式细胞仪（型号FACSCANTOⅡ）产自美国BD公司。

3.标本的收集与检测：抽取受试者外周血8 ml，分为抗凝血4 ml和促凝血4 ml。将抗凝血在4 h内进行流式细胞仪分析；用促凝血分离血清，-80℃冰箱保存待测，采用ELISA双抗体夹心法测定血清IL⁃17A、IL⁃27浓度。

（1）流式细胞仪检测Treg细胞：按照试剂盒说明书进行。将100 μl抗凝血样品加入到流式管，分别加入CD4抗体、CD25抗体、CD127抗体，室温避光孵育20 min；将450 μl红细胞裂解液加入流式管中，室温避光孵育10 min；离心5 min，弃上清液；PBS清洗后重悬细胞，2 h内使用流式细胞仪检测，用软件BD FACSDiva 7.0对检测数据加以分析。

（2）ELISA检测血清IL⁃27、IL⁃17A浓度：分别按照试剂盒说明书进行。最后于酶标仪上450 nm波长处检测每孔的吸光度，并计算IL⁃27和IL⁃17A浓度。

4.疾病评分判定标准：根据EAACI/GA2LEN/EDF/WAO制定的荨麻疹活动性评分（UAS）［3］评估。瘙痒：0分为无症状，1分为轻微症状，2分为中度症状对生活存在一定影响，3分为严重症状不能忍受。风团数目：0分为无风团，1分为新发风团1～19个/24 h，2分为20～50个/24 h，3分为＞50个/24 h。风团与瘙痒评分之和为UAS总分。

5.统计学分析：采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料在方差齐性检验后进行t检验，相关性分析使用Spearman相关检验，显著性检验水平为0.05。

二、结果

CSU患者组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例（图1）和血清IL⁃27水平均低于对照组（P＜ 0.01）；血清IL⁃17A水平两组间差异无统计学意义（P=0.529），见表1。CSU患者CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例与血清IL⁃17A水平呈负相关（r=-0.359，P=0.029），与IL⁃27无显著相关性（r=-0.141，P=0.404），IL⁃17A与IL⁃27亦无显著相关性（r=0.053，P=0.754）；CSU患者UAS评分与IL⁃17A水平、IL⁃27水平、CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例均无显著相关性（r值分别为-0.076、-0.083、-0.053，均P＞ 0.05）。

三、讨论

Treg细胞是一类具有免疫抑制性的T细胞亚群，在维持机体免疫耐受和免疫稳态中具有重要作用［4］。转录因子叉头状/翼状螺旋转录因子 3（forkhead or winged helix transcription factor 3，Foxp3）是人细胞的特异性标志，是Treg细胞分化、发育的关键调节因子［5］，既往研究常使用CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例反映Treg细胞水平，但使用Foxp3标记时，处理标本需要固定、打孔等步骤，导致细胞损伤，使Treg细胞检出率与实际水平相差较大。最近研究发现，使用CD4+CD25+CD127low标记Treg细胞时可以避免Foxp3标记过程中导致的细胞损伤，保证Treg细胞更好的活性和完整性，更准确地反映实际水平，故本研究使用CD4+CD25+CD127low细胞比例反映Treg细胞水平是目前较为理想的检测指标［6］。我们发现CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分比及IL⁃27水平均明显低于健康对照组，与既往结果一致［2，7］。Arshi等［7］认为慢性荨麻疹的免疫失调由Treg细胞比例下降引起，慢性荨麻疹中Th17/Treg比例失衡，并且其相关细胞因子及趋化因子在CSU发病中具有重要作用，但Th17/Treg细胞如何发挥作用目前并未阐明。本研究显示，IL⁃17A水平在CSU患者及健康对照组之间并无明显差异，这与Arshi等［7］研究一致，但与国内部分学者的研究结果并不一致［2，8］，我们推测可能与实验人群所在区域的地理及人文环境不同有关。李润祥等［8］认为，IL⁃17A经血液循环到达皮肤和黏膜，释放更多炎症因子，促进机体全身和局部免疫应答及炎症反应是造成CSU发病的重要机制。IL⁃27可以通过STAT1途径抑制IL⁃17A产生，抑制Th17细胞生成［9］，同时对Treg细胞具有双向调节作用［10］，但在CSU发病中的作用尚不知晓。我们研究发现IL⁃27在CSU发病中，可能对Treg细胞具有正性调节作用，但对Th17细胞的作用与IL⁃27的生理作用不一致，这可能是由于IL⁃27仅是影响Th17细胞分化途径中的一个方面，还有更多的未知因素影响CSU发病机制中Th17细胞分化途径。作为调节Th17细胞及Treg细胞的关键细胞因子，IL⁃27降低可能是CSU患者Th17/Treg细胞失衡的重要原因。

CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例及IL⁃27水平均明显低于健康对照组，但两者之间无明显相关性，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例与IL⁃17A水平之间呈负相关。由此我们推测Treg细胞比例降低，可能导致炎症反应加重，同时IL⁃17A促炎作用进一步加重炎症反应；CSU患者体内IL⁃27水平降低可能会导致CSU患者T细胞亚群比例失调，且可能使Treg分泌IL⁃10减少，负性调节作用减弱。因此笔者认为在CSU患者体内存在Th17细胞与Treg细胞之间的失衡。本研究未发现IL⁃27与CD4+CD25+CD127lowTreg细胞之间存在相关性，二者之间的联系及作用机制尚需进一步研究；Treg细胞比例、IL⁃17A和IL⁃27水平与UAS评分无明显相关性，推测三者可能只参与CSU发病及调节过程，不能反映其严重程度。今后应对CSU患者体内Th17/Treg细胞轴及其相关因子的功能和调节途径进行深入研究。

图1 流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例

表1 慢性自发性荨麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例、IL⁃17A和IL⁃27水平（±s）

表1 慢性自发性荨麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例、IL⁃17A和IL⁃27水平（±s）

注：IL，白细胞介素

CD4+CD25+CD127low Treg（%）5.99±2.72 9.07±3.44 4.325 0.000组别患者组对照组t值P值例数37 40 IL⁃27（ng/L）20.54±7.65 26.63±9.72 3.039 0.003 IL⁃17A（ng/L）53.81±8.55 52.82±4.35 0.633 0.529

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Proportion of regulatory T cells and expression of interleukin⁃17A and ⁃27 in the peripheral blood of patients with chronic spontaneous urticaria and their significance

Wang Yating,Shi Chunrui,Wu Yi,Shi Bei,Xiong Xiao,Zhou Lanxia
Department of Dermatology and Venereology,The First Hospital of Lanzhou University,The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

Shi Chunrui,Email:stone7207@126.com

ObjectiveTo explore the role of peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg cells,interleukin⁃17A（IL⁃17A）and IL⁃27 in the pathogenesis of chronic spontaneous urticaria（CSU）.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 37 patients with CSU（CSU group）and 40 healthy controls（control group）.Flow cytometry was performed to determine the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood,and enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）to detect the serum levels of IL⁃17A and IL⁃27.ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood（5.99%±2.72%vs.9.07%±3.44%,t=4.325,P＜0.01）and the serum level of IL⁃27（20.54±7.65 ng/Lvs.26.63±9.72 ng/L,t=3.039,P=0.003）were both significantly lower in the CSU group than in the control group.However,there was no significant difference in the serum level of IL⁃17A between the 2 groups（P=0.529）.Among the patients with CSU,the level of IL⁃17A was negatively correlated with the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.359,P=0.029）,while the urticaria activity score（UAS）was uncorrelated with the levels of IL⁃17A and IL⁃27 as well as the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.076,-0.083,-0.053 respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThere may be Th17/Treg imbalance in the peripheral blood of patients with CSU,and IL⁃27 may be involved in the occurrence of CSU.

Urticaria;Interleukin⁃17;T⁃lymphocytes,regulatory;Interleukin⁃27

Fund program:Health Industry Research Project of Gansu Province（GWGL2014⁃60）

石春蕊，Email：stone7207@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.014

甘肃省卫生行业科研计划管理项目（GWGL2014⁃60）

2016⁃12⁃11）

尚淑贤）