不同浓度纳米氧化铁对西瓜幼苗生长的影响

王运强，甘秋良，戴照义，陈 港，郭雅新，李俊丽*

(1.湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北 武汉 430064；2.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070)

不同浓度纳米氧化铁对西瓜幼苗生长的影响

王运强1，甘秋良2，戴照义1，陈 港2，郭雅新2，李俊丽2*

(1.湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北 武汉 430064；2.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070)

【目的】研究不同浓度纳米氧化铁对西瓜幼苗生长的影响。【方法】采用不同浓度纳米氧化铁对西瓜幼苗进行处理后，对植株根系生物量、抗氧化酶活性等进行测定。对比不同粒径纳米氧化铁对西瓜叶片影响的研究，比较纳米处理对植株地上地下部分影响的差异。【结果】不同浓度的纳米氧化铁对西瓜根系生长有影响，低浓度时对植株生长起促进作用，高浓度时促进作用减弱或起抑制效果，呈现出一定的植物毒性。【结论】低浓度的纳米氧化铁有利于植物的生长，在弄清剂量、毒性及尺寸效应的基础上，有望将纳米氧化铁作为纳米肥料或植物生长调节剂用于农业生产上。

不同浓度；纳米氧化铁；根系生长；西瓜

【研究意义】铁作为植物必需的营养元素，与光合作用密切相关，它不仅影响光合作用中的氧化还原系统，还参与叶绿素合成，影响叶片对光能的捕获。缺铁会导致叶绿体的结构受损，叶绿素无法生成，从而使植物新生的叶片会出现缺铁黄化现象[1]。对植物而言，铁的存在形式是实现其功能有效的关键。目前传统方法使用的铁强化剂对植物进行补铁时，难以转化为能有效利用的铁，不能很好地发挥出改善植物黄化的功效，所以目前对植物正确施铁的方法还有待研究。【前人研究进展】纳米颗粒是一种空间结构上至少有一维介于1～100 nm的颗粒状材料。由于其结构上的特殊性，纳米粒子在多方面具备常规物质没有的理化特性，例如团聚效应，表面效应等，使其在各个领域都有较好的功效和广泛的应用前景。故而，对于纳米颗粒本身及其在人类生活应用的研究已在全世界掀起了大波澜[2]。γ-Fe2O3,针状或纺锤状,具亚铁磁性，结构为阳离子缺位的尖晶石型[3]。有研究把纳米氧化铁与有机肥、腐殖酸配合施用，探究其对花生生长发育和吸收铁肥的影响，结果表明,纳米氧化铁能够显著地促进花生的生长发育和光合作用[1]。近些年来,随着纳米科技的广泛应用，关于纳米颗粒对植物生长的影响,以及其在植物体的吸收迁移、生物可利用性以及生物富集的研究已经开始出现[4]。纳米颗粒的尺寸大小和浓度都是造成这些生理影响差异的因素，特定的尺寸和浓度产生的作用效果更明显[5]。【本研究切入点】本研究开展了对缺铁处理的西瓜幼苗施用不同浓度纳米 γ-Fe2O3的实验。【拟解决的关键问题】结合本实验室之前关于不同粒径纳米 γ-Fe2O3对西瓜叶片生理影响的研究[6]，通过观察测量相关生长生理指标，探究不同浓度的纳米 γ-Fe2O3处理对西瓜幼苗生长发育的影响，为进一步阐明纳米 γ-Fe2O3在植物体内吸收、转运机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

纳米磁性氧化铁(γ-Fe2O3)，颗粒粒径20 nm，球形，纯度为99.5 %，购自麦克林公司。纳米氧化铁悬液配制：将纳米 γ-Fe2O3用超声震荡的方式分散到去离子水中形成均一稳定的悬浮液。

在超净工作台中将浸泡了3 h的去壳西瓜种子用75 %的乙醇洗涤30 s，再用8 %的次氯酸钠浸洗10 min，用无菌水冲洗3次。将消毒处理好的种子包裹在已灭菌的滤纸中，并用无菌水润湿滤纸，放在培养皿中置于32 ℃恒温培养箱中培养，2 d后大部分种子露白，将萌发的种子播入潮湿的珍珠岩中，置于人工气候箱中培养。

1.2 实验方法

幼苗长到2叶1心时，选取长势近似的植株移植于7组水培盆中，每盆18株，用去离子水适应培养1周后，开始改浇缺铁的Hoagland营养液，1周后进行纳米氧化铁处理。将上述纳米 γ-Fe2O3悬液与营养液混匀，使得最终营养液中纳米 γ-Fe2O3浓度为0、20、50、100、200 mg/L，对7组幼苗分别浇灌含不同浓度 γ-Fe2O3的营养液，以在50 mg/L的纳米 γ-Fe2O3具有相同铁元素含量的Fe2+和Fe3+溶液作为对照，在相同的条件下置于人工气候箱中培养。环境条件设计为：每天在28 ℃下光照培养16 h，18 ℃下黑暗培养8 h，连续培养14 d。期间，每天需将营养液超声分散，以免纳米粒子发生聚沉。

1.3 实验测定

1.3.1 根生物量测量 在每个培养盆中随机选取6株幼苗，于根茎相接处剪去地上部分，用去离子水冲洗根部，并用吸水纸吸干后分别测量根长及根重[7]。

1.3.2 根系活力的测定 采用TTC法测定根系活力[4]：取上述已称重的根放入15 mL离心管中再加入0.4 % TTC和PBS(pH 6.0)各5 mL，使根完全浸没在溶液中，于37 ℃下保温2 h，此后加入2 mL(1 mol/L)硫酸以终止显色反应。向已显色的根加10 mL甲醇，于40 ℃下保温7 h。取其溶液于485 nm测定吸光度值。

1.3.3 脂质过氧化作用的测定 丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化作用的最终分解产物，是常用的膜脂过氧化指标。取0.1 g剪碎的根，加入少量PBS(pH 6.0)快速研磨至匀浆，4000 r/min离心10 min后将上清全部转移并定容至10 mL得到提取酶液。吸取1 mL粗提液加入2 mL TBA(0.6 %)沸水浴反应15 min，冷却后分别测定532、600和450 nm下的吸光度值。

1.3.4 抗氧化酶系统活力测定 取1.3.3粗提液进行抗氧化酶系统的活力测定[8]。SOD采用氮蓝四唑法测定；POD采用愈创木酚法测定；CAT采用比色法测定。

1.4 统计分析

所有实验设计3次重复。所得数据用IBM SPSS Statistics 21进行单样本t-检验和方差分析，用Origin 75进行图片制作。

2 结果与分析

2.1 纳米 γ-Fe2O3对根系生长发育的影响

根系长度和根重是反映植物根系生长发育状况的一个指标。Fe2+处理组是适宜西瓜幼苗生长的处理组，在此处理下根长和鲜重指标最高。以缺铁处理组作为对照组，从图1可以看出，在不同浓度纳米 γ-Fe2O3处理下西瓜根系长度和鲜重均有明显变化：低浓度的纳米 γ-Fe2O3对西瓜根系伸长和生物量积累有一定促进作用，高浓度的纳米 γ-Fe2O3处理对生物量积累的促进作用有所下降。当浓度达较适宜浓度50 mg/L时，促进作用较为显著，优于其他浓度下的处理组，而且该浓度下纳米 γ-Fe2O3对西瓜根伸长和生物量积累的促进作用和Fe2+组的效果接近，这表明纳米 γ-Fe2O3在该浓度下有和Fe2+相近的补铁作用。此外，与Fe3+处理组实验结果呈现的毒害现象相比较，纳米 γ-Fe2O3对西瓜幼苗根系产生作用的方式并非通过释放Fe3+，而是通过其他的方式对植物生理产生影响。在0～200 mg/L纳米 γ-Fe2O3暴露下，没有发现纳米 γ-Fe2O3对根系伸长有明显抑制作用，但从根重在高浓度时受抑制这一现象可以推测纳米 γ-Fe2O3对西瓜种子根系细胞生长发育的影响可能作用于细胞壁结构上，主要作用是促使细胞纵向伸长，而非增加细胞质量。

图1 不同处理下西瓜幼苗根系长度和鲜重变化Fig.1 Variability of root length and weight of the watermelon under different treatments

2.2 纳米 γ-Fe2O3对根系活力的影响

根作为植物吸收营养的主要器官，根系活力代表的是植物整体的生长情况、吸收营养的能力大小。通过对比纳米 γ-Fe2O3处理对西瓜叶片产生影响的实验[6]，发现纳米 γ-Fe2O3的粒径不同，浓度不同都是造成纳米颗粒对根系生长影响结果不同的关键因素[9]，可借此来研究纳米颗粒与西瓜根系细胞的相互作用方式。如图2所示,低浓度的纳米 γ-Fe2O3对植物根系活力有促进作用，可能是因为植物为维持自身生长需求需从外界吸取足够的铁元素，在游离铁含量不高的情况下，植物通过提高根系活力以加大对营养液中纳米 γ-Fe2O3的吸收，与此相伴的营养元素的跨膜运输等耗能过程也是促进根系活力提高的动力；高浓度纳米 γ-Fe2O3处理对植物根系活性表现出一定的抑制作用，该现象可解释为高浓度的纳米颗粒发生团聚堵塞了西瓜根系毛孔，影响根毛细胞对水分和营养的吸收，使得根系活力呈现下降趋势。该趋势与我们之前的研究用9和18 nm的纳米 γ-Fe2O3对叶片处理取得的结果相符[6]，相对于对照组，20 mg/L的纳米 γ-Fe2O3处理有促进根系活力的积极作用，而50 mg/L的纳米处理组的根系活力明显下降。另外，在粒径上对比，纳米颗粒粒径20，18，9 nm处理下对西瓜根系活力产生抑制的浓度稍有不同，粒径越小产生抑制效果所需浓度越低，说明小粒径的纳米颗粒因更易发生团聚堵塞根毛，在低浓度时便会对根系活力产生抑制作用[6]。在适宜西瓜幼苗生长的Fe2+处理组中，西瓜根系细胞并没有表现出较高的根系活力，这很可能与溶液中游离铁的含量较高有关，西瓜根系细胞吸收这些铁并不需要很高的能量，相应的根系活力也就较弱。叶绿素是植物光合作用必不可少的物质，它的含量直接反应植物的生长活力，从西瓜叶片实验[6]中发现低浓度下随着纳米 γ-Fe2O3的施加，叶绿素含量有轻微上升的趋势，这从另一角度说明纳米 γ-Fe2O3有可能为植物缺铁黄化防治提供新的途径，为高效纳米复合肥料的推广与运用奠定基础。

2.3 纳米 γ-Fe2O3对根系抗氧化系统的影响

为了更好地生长发育，植物会形成多种抵抗外界胁迫的防御机制，抗氧化系统就是植物抵抗活性氧自由基对自身伤害的机制之一[10]。超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，过氧化氢酶(CAT)都是抗氧化保护酶，这些抗氧化酶的活性变化有利于维持体内活性氧的动态平衡。通常情况下，当外界胁迫刺激导致平衡破坏时，酶活性的变化直接反映了西瓜根系细胞受胁迫的程度。从图3(A)的结果与之前关于不同粒径纳米 γ-Fe2O3对西瓜幼苗叶片抗氧化系统的影响相比较发现[6]，不同粒径的纳米 γ-Fe2O3处理西瓜幼苗根和叶片中SOD活性变化均呈平缓趋势，并且总体水平高于Fe2+处理组。说明，纳米 γ-Fe2O3通过刺激ROS积累诱导氧化应激提高抗氧化酶活性。从图3(B)中可看出，粒径20 nm纳米 γ-Fe2O3处理下的西瓜幼苗根细胞中POD活性变化不显著，与叶片实验[6]中粒径18 nm纳米 γ-Fe2O3处理下西瓜叶片细胞中POD活性相比较发现，根细胞中POD酶活性整体高于叶片中的酶活性，这可能与纳米 γ-Fe2O3在西瓜幼苗中的转运量有关，根最先接触纳米 γ-Fe2O3产生较强的氧化应激，随后纳米 γ-Fe2O3部分转运到上部组织，因而产生的影响不及根部细胞的强烈。此外，叶片实验[6]中粒径9 nm的纳米 γ-Fe2O3处理下POD酶活性稍高于18 nm纳米 γ-Fe2O3处理中的，这说明小粒径的纳米 γ-Fe2O3更有机会被吸收运输到植物上部组织中。已知CAT酶和POD酶主要作用是清除细胞内过多的H2O2，减少H2O2对膜脂质的过氧化作用，稳定膜的结构。从图3(C)中可看出，施加了纳米 γ-Fe2O3后根中CAT酶活性均比对照组有所提高。随纳米颗粒浓度的增加，CAT酶活性变化不大。这与叶片中CAT酶活性变化趋势一致。对比根和叶片中CAT酶活性值发现，叶片中CAT酶活性整体高于根细胞酶活，说明叶片在清除脂质过氧化物的能力上更优于根细胞，究其原因，可能是根细胞最先接触较高浓度的纳米 γ-Fe2O3发生较强氧化应激反应，从而刺激了细胞自身的保护机制，抑制了酶活力，而纳米 γ-Fe2O3经吸收转运再到叶片时，较每个浓度下根细胞所接触的浓度低，叶片中酶活力较高处于活跃状态为机体清除自由基，从而造成叶和根中酶活性的区别。这侧面说明纳米 γ-Fe2O3在植株中有一定的运输。

图2 不同处理下西瓜根系活力变化Fig.2 Variability of root activity of the watermelon under different treatments

A：超氧化物歧化酶活性(SOD) ;B：过氧化物酶活性(POD) ;C：过氧化氢酶活性(CAT);D：过氧化氢酶抗氧化机理方程式图3 不同处理下西瓜幼苗根系抗氧化酶活力变化Fig.3 Variability of antioxidant enzyme activity of the watermelon under different treatments

2.4 纳米 γ-Fe2O3对根系丙二醛(MDA)含量的影响

当细胞内产生过量的活性氧时，会引发膜脂过氧化，丙二醛是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量可以表示膜脂过氧化的程度[11]。MDA含量越高，说明细胞膜系统受损越严重。和叶片实验中MDA含量水平对比，从图4中可看出，根细胞中MDA水平整体高于叶片中MDA水平。这说明根细胞膜脂过氧化程度较叶片中的高，根作为直接和最先接触纳米颗粒的器官，其细胞膜受损的程度大于纳米颗粒经转运后对叶片造成损伤的程度，这和上文抗氧化系统中酶活性在根细胞和叶细胞中的差异一致。较低的MDA含量对于保护细胞膜的结构和功能很有必要，正常铁供给的Fe2+处理组的MDA水平不低，分析原因极有可能是缺铁胁迫处理的逆境下已对植物细胞膜产生影响，补铁有一定的恢复效果但不能完全抵消缺铁造成的损伤。在缺铁处理组中，由于缺铁导致植物内囊体膜受到一定的损伤，植物体内的MDA的含量较高，在不同浓度纳米 γ-Fe2O3处理下MDA含量稍有下降但变化不显著，说明纳米 γ-Fe2O3的补铁效果和其产生的氧化损伤程度之间有一定的竞争关系。在叶片[6]中9 nm粒径的纳米 γ-Fe2O3在50 mg/L时使MDA呈现反常的下降趋势可能归结于纳米颗粒小粒径的团聚效果，使其不易穿过细胞壁和细胞膜，避免对细胞造成强烈的氧化损伤，这启发可以继续设计不同粒径和浓度梯度纳米颗粒处理，并找到最佳补铁效应和最低氧化损伤的处理方案。

图4 不同浓度纳米γ-Fe2O3处理下西瓜幼苗根系MDA含量变化Fig.4 Variability of MDA content of the watermelon under different treatments

3 讨 论

整个实验通过对缺铁处理的西瓜幼苗施用不同浓度纳米 γ-Fe2O3进行处理的方法，结合实验室关于不同粒径纳米氧化铁对西瓜叶片生理影响的研究[6]，分析纳米 γ-Fe2O3对西瓜根系生长的影响。实验结果表明，不同浓度纳米 γ-Fe2O3对西瓜根系的长度、鲜重有一定的影响，浓度从低到高的纳米 γ-Fe2O3对西瓜根系伸长和生物量积累的促进作用呈现下降趋势，其中出现的根伸长但根重增加不明显的现象，对纳米 γ-Fe2O3的作用机制有参考意义，纳米颗粒是否只是与根细胞壁相互作用，破坏其某些结构刺激细胞伸长，具体机制需制定新的方案进一步进行探究。此外，纳米颗粒的团聚效应堵塞根毛，一方面体现在高浓度纳米处理时对植物根系活性表现出一定的抑制作用，另一方面体现在纳米颗粒粒径越小产生抑制效果所需浓度越低[6]。相比较而言，低浓度的纳米 γ-Fe2O3对植物根系活力的促进作用在一定程度上优于其他处理组。与之前的研究关于纳米铁对西瓜叶片影响的实验[6]联系起来，不同浓度不同粒径的纳米 γ-Fe2O3对植物不同组织部位产生的影响既有相同点又有不同之处[9]，一定程度上说明纳米 γ-Fe2O3对植物作用的机制有可能是通过外部生理压力，也可能是吸收转运，这需进一步进行实验验证。西瓜植株在受到纳米氧化铁胁迫时，会启动相应的防御机制来对抗氧化胁迫，使机体的生理状态正常进行，减少机体受损害的可能性，这表明西瓜对纳米 γ-Fe2O3有一定的生物适应能力。而高浓度下的纳米 γ-Fe2O3都没有出现与Fe3+相似的强毒害作用，可以说明纳米γ-Fe2O3对植物生理产生的影响并非是通过释放Fe3+来起作用，而且一定程度上纳米 γ-Fe2O3有和Fe2+相同的改善缺铁症状的效果，某些指标上甚至更优，也说明纳米 γ-Fe2O3运用于西瓜缺铁改善方面有一定的研究可能性。进一步研究纳米 γ-Fe2O3在西瓜幼苗根系附近和根细胞内的赋存状态，及体内生物物质表达含量的差异性，并加深到相关调控机制的分子层面可能会有新突破。同时考虑到纳米颗粒对环境问题和人类健康问题的未知风险，在实际应用之前需仔细开展纳米颗粒安全性的研究。

4 结 论

综上所述，不同浓度的纳米氧化铁对西瓜根系生长有影响,较低浓度的纳米氧化铁能被植物根吸收并转运到植物上部，并有效的促进植物的生长发育，而随着纳米氧化铁浓度的增高，其积极作用逐渐减弱。此外在相同浓度下，较小尺寸的纳米氧化铁表现出更大的植物毒性。这些结果评估了合适的剂量和尺寸的纳米氧化铁在植物缺铁黄化病上的修复效果，为探究纳米材料的植物分子毒性机制提供了重要的依据，也为其作为新型的纳米肥料或植物生长调节剂在农业上的应用提供了参考，一定程度上促进了纳米肥料在农业和园艺领域的发展。

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EffectofDifferentConcentrationsofIronOxideNanoparticlesonGrowthofWatermelon

WANG Yun-qiang1,GAN Qiu-liang2, DAI Zhao-yi1,CHEN Gang2,GUO Ya-xin2,LI Jun-li2*

(1.Institute of Economic Crops, Hubei Academy of Agricultural Science, Hubei Wuhan 430064，China；2.School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, Wuhan University of Technology,Hubei Wuhan 430070，China)

【Objective】The research was designed to evaluate the influence of γ-Fe2O3NPs with different concentration on the growth of watermelon seedlings. 【Method】Root biomass and antioxidant enzyme activity were measured in plants exposed to different concentrations of γ-Fe2O3NPs. By comparing the results with the impact on leaves of watermelon of γ-Fe2O3NPs with different particle size, different impact on aerial and underground part of watermelon seedlings was also discussed. 【Result】Effects of γ-Fe2O3NPs were related with concentration. The effects of γ-Fe2O3NPs at lower concentration was positive on plant growth, while at high concentration the effects were weakened or inhibited, which presented phytotoxicity. 【Conclusion】 Low concentration of γ-Fe2O3NPs has positive effects on plant growth. Based on further understanding of dose, toxicity and size effects, γ-Fe2O3NPs are expected to be used as a nano-fertilizer or plant growth regulator in agricultural production.

Different concentrations; γ-Fe2O3NPs; Root growth; Watermelon

1001-4829(2017)12-2782-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.028

2017-02-18

国家现代农业产业技术体系专项资金资助项目(CAR S-26-34)；湖北省技术创新专项(2016AHB028)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(WUT: 2017IB006)；国家大学生创新创业训练计划(20161049720006)

王运强(1977-),男，湖北武汉人,硕士,从事西甜瓜育种与栽培,E-mail:wangyunqiang0909@sina.com,Tel:13387601706，*为通讯作者：李俊丽(1980-),女，湖北武汉人，博士，主要研究方向，纳米生物效应，E-mail:lijunli0424@sina.com，Tel：18971243840。

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(责任编辑李 洁)