水稻小孢子发育过程中花药超微结构研究

郑 灵，肖培村，谢从简，曹厚明，赵 鹏，陈 勇

(内江农业科学院杂交水稻科技开发中心，四川 内江 641000)

水稻小孢子发育过程中花药超微结构研究

郑 灵，肖培村，谢从简，曹厚明，赵 鹏，陈 勇*

(内江农业科学院杂交水稻科技开发中心，四川 内江 641000)

【目的】水稻小孢子发育过程直接影响成熟花药的育性，进行系统的细胞学研究揭示不同发育时期的结构特征具有重要意义。【方法】结合形态观察与光镜分析，运用扫描电镜以及透射电镜技术，分别对小孢子发育过程中水稻花药外表皮角质层的发育过程以及内部细胞的形态发育进行了系统观察和分析。【结果】①在花粉发育过程中，绒毡层细胞结构变化最为明显。减数分裂前期，绒毡层细胞结构完整，随着减数分裂的进行，绒毡层细胞质浓缩，细胞内呈现空泡化，内质网清晰可见，此后逐渐消失。②空泡期早期花药表皮细胞外部逐渐增厚，最终形成具有保护功能且对花药正常发育至关重要的角质层。③乌氏体作为绒毡层细胞向雄配子体运输物资的直接通道，是在小孢子早期在绒毡层靠近雄配子体侧开始形成，参与绒毡层细胞内脂肪酸以及其他营养物质的运输。④在乌氏体形成的同时，小孢子外壁物质快速沉积，最后形成小孢子外壁结构。【结论】本研究观察了花药发育多个关键时期的细胞学特征，且发现了不同组织与功能相关的精细结构，对花药发育的研究具有指导作用。

水稻；花药发育；绒毡层细胞；角质层；乌氏体；小孢子外壁

【研究意义】开花植物的雄性生殖发育是一个非常复杂的生物学过程，起始于分化组织形成花药。花药的发育进程直接影响最终能否形成成熟的花粉，因此对其发育过程中结构特征的研究尤为重要。 【前人研究进展】在花药形态建成以后，小孢子母细胞由四层细胞包裹，从外到内分别是外表皮、药室内壁、中间层以及绒毡层。伴随小孢子母细胞的发育，这四层细胞在形态上都随之而变化，而其中外表皮角质层增厚、绒粘层细胞的降解、乌氏体以及小孢子外壁的形成对小孢子发育至关重要。对于水稻花药发育超微结构研究已经积累了很多资料[1-3]，且研究的较为细致。【本研究切入点】本研究运用常规石蜡切片、扫描电镜与透射电镜对水稻花药发育进行了系统的观察。【拟解决的关键问题】旨在发现小孢子发育阶段花药细胞的结构特征变化，其结果进一步认识了水稻小孢子发育过程中各种细胞的结构变化，揭示超微结构与组织细胞功能间的联系，有助于开展雄性不育发育过程中的比较研究。

1 材料与方法

运用籼稻品种内恢9914，2016年正季种植于内江杂交水稻中心实验基地，常规方法管理。从幼穗发育进入雌雄蕊原基形成期开始直至开花为止进行取样，根据小穗不同长度处于不同发育时期的幼穗进行固定[4]。

不同发育时期的花药采用戊二醛-锇酸双固定，LR white树脂包埋，半薄切片，在光镜下观察确定发育时期，从中选出理想的各个时期的材料进一步制备超薄切片，在Tecnai G2F20型透射电子显微镜下观察、拍照，加速电压为80kV。

取不同发育时期的花药采用戊二醛-锇酸双固定，经系列酒精脱水，醋酸异戊酯浸透，液体CO2临界点干燥(日立HCP-2型)，真空喷镀金，标本置于JEM-1200 EX扫描电镜观察，拍照，加速电压为20 kV。

2 结果与分析

2.1 小孢子的发育阶段

根据幼穗不同发育阶段的形态变化，确定了花药发育减数分裂时期、小孢子时期、空泡期、二胞花粉时期以及成熟花粉时期相对应的颖花形态(图1)。同时通过对相应时期的幼穗进行常规脱水包埋后半薄切片并用光镜观察确定花药的时期(图2)。

2.2 绒毡层结构变化

在减数分裂时期，绒毡层细胞体积明显比表皮细胞、药室内壁细胞、中层细胞都要大，且原生质浓，细胞器丰富，液泡少而小(图3A)。其中线粒体分布于核的周围，而质体多位于绒毡层的内切向壁一侧，表现出极性分布现象。这时的绒毡层细胞结构完整，内切向壁稍厚。

在四分体时期到小孢子时期，绒毡层细胞中质体的数量增多，原生质体进一步浓缩，但其内细胞器仍十分丰富，其中以内质网最为明显，呈高度发达状态。绒毡层细胞在四分体时期后开始解体，出现单个或几个连在一起随机分布的小泡囊，细胞核开始解体，核膜消失。且这一时期绒粘层细胞内侧区域分散着大量染色较深的脂肪体(图3B)。

A:减数分裂时期；B:四分体时期；C:空泡期；D:二胞花粉时期；E:成熟花粉时期。Le外稃；pa内桴；gl颖片；st花药图1 水稻不同发育时期颖花解剖图Fig.1 Anatomical diagram of rice flowers in different developmental stages

A:减数分裂(二分体)时期；B:四分体时期；C:小孢子时期；D:空泡期；E:成熟花粉时期图2 水稻花药不同发育时期石蜡切片观察Fig.2 Paraffin serial section analysis of rice anther in different developmental stages

(A)到(D)为内恢9914 分别在减数分裂、小孢子时期、花粉有丝分裂早期、成熟花粉时期的横切面；(E)到(H)为(A)到(D)中靠近绒毡层内侧区域的放大分析；(I)到(L)为(A)到(D)中外表皮细胞外侧区域的放大分析。Ba,孢子外壁柱状层；C，角质层； En，药室内壁细胞；Ep，外表皮细胞； Ex，孢子外壁；He,孢子外壁基层；L，脂肪体；M，中层细胞；Msp，小孢子细胞；Nu，细胞核；Or，乌氏体；P，花粉；Pl，质体；PM，质膜；PT，绒毡层内侧；Se，孢子外壁覆盖层；T，绒毡层；Ve，空泡图3 花药不同发育时期透射电镜观察Fig.3 Transmission electron microscopy analyses of rice anther in developing stages

在小孢子晚期(空泡期)到花粉有丝分裂早期绒毡层细胞核消失，核物质渗透到细胞质中，细胞径向厚度变薄且出现前乌氏体结构，细胞器降解，整个绒毡层细胞几乎成透明状，但绒毡层细胞间界限清晰，质膜没有降解。同时绒粘层靠近乌氏体内侧区域脂肪体数目有所降低(图3C)。

当花粉完全成熟时，绒毡层细胞已完全退化解体。仅留一条小而窄的带状残留，中层细胞此时也已完全解体，残留的中层细胞壁和绒粘层细胞内切壁一起形成叠合的“壁”包裹着花粉。绒粘层细胞靠近成熟乌氏体一侧脂肪体消失(图3D、3H)。

2.3 乌氏体的发育

在小孢子中期绒粘层细胞开始解体、细胞径向壁变薄时，前乌氏体已部分暴露于药室腔，前乌氏体表面开始沉积孢粉素物质(图3C、图3G)，绒毡层细胞内切向面的质膜上也有前乌氏体分布，其上孢粉素物质同样有沉积。

随着花粉的进一步发育，孢粉素物质的逐渐积累，乌氏体发育逐渐成熟，均匀地排列在药室腔内表面上。成熟乌氏体中央着色浅，而四周着色较深，其上不均匀地沉积孢粉素物质(图3D、图3H)。最终形成类似马蹄形的结构。

2.4 小孢子外壁的沉积

早在四分体时期胼胝质壁就包裹在四分体细胞外围，在此基础上,随着发育的进行，小孢子早期小孢子的外壁就形成了可以分辨的带状结构，其带状结构上附着了很多黑色的颗粒(图3F)，同时黑色颗粒也存在于小孢子的周围。

等到小孢子中期到空泡期时，孢子外壁胞粉素快速沉积，形成了由两侧电子致密带以及中间空隙形成的带状栅栏结构，到空泡期后期时两边的电子致密带明显加宽，结果分别形成了孢子外壁的覆盖层、柱状层、基层(图3G)。至此孢子外壁基本形成，即由中间的透明带和两边较宽的电子致密带组成的带状栅栏结构。

花粉发育的后期，孢子外壁的外形基本保持不变，但壁物质沉积增多，而表现为更加致密。中间柱状层透明带区清晰可见且覆盖层、基层中间有柱状通道连接(图3H)。

2.5 角质层的形成

在绒毡层细胞通过前乌氏体往药室腔供给胞粉素以形成外孢壁的同时，外表皮细胞细胞壁外也逐渐形成一层着色较浅的结构(图3I-J)，该结构就是角质层。在四分体时期角质层还只是薄薄的覆盖在细胞壁外，但到了小孢子时期、空泡期早期就逐渐加厚，形成靠近内侧着色较深的角质、靠近外侧的蜡质结构，而且外部的蜡质堆积成脊状结构(图3K)。到了成熟期角质随着积累的过程着色更深，而蜡质则由脊状结构发育成棘状突起(图3L)。为进一步直观的观察花药发育过程外表皮细胞壁的形态变化过程，笔者对处于3个重要发育时期的花药进行扫描电镜观察，其结果验证的透射电镜的结果：在减数分裂以及四分体时期花药的表皮细胞壁上未完全形成，细胞小且分界不明显；待花药发育到小孢子时期，细胞胀大、轮廓清晰可见但仍然很小、且表面光滑无物质堆积；当进入空泡期，表皮细胞充分伸长、表面形成致密的网状结构；在成熟花粉中网状结构更加致密(图4)。

(A)到(C)为内恢9914 外表皮细胞角质层分别在减数分裂、小孢子时期、空泡期后期的扫描图片图4 花药发育各个时期扫描电镜观察Fig.4 Scanningelectron microscopy analyses of rice anther in developing stages

3 讨 论

3.1 绒毡层细胞在花药的发育过程中具有重要功能

处于花药壁四层体细胞中最里层，绒毡层直接与花药药室中的花粉母细胞及以后发育中的花粉接触，在小孢子到成熟花粉发育的过程中扮演重要的角色[5]，是将孢子体组织的物质输往雄配子体的中转站。作为分泌性细胞，绒毡层提供四分体胼胝质降解释放小孢子细胞所必须的酶类、花粉发育所需要的营养物质、以及花药壁发育所需要的胞粉素等长链脂肪酸[6]。本研究观察到四分体时期脂肪粒大量存在于绒毡层细胞内切向壁，到花药有丝分裂早期数目明显下降，直至最终消失。从而直接从形态上验证了绒粘层细胞在合成大量脂肪类物质的同时会伴随小孢子的发育过程而变化。绒粘层细胞在花粉发育晚期启动细胞程序性死亡，在细胞降解的过程中，细胞内结构相继消失。在已报道的有关雄性不育研究中，常因为绒毡层的提前降解[7-8]、延迟降解[9]或不降解而导致雄性败育。

3.2 乌氏体可能是绒毡层细胞内营养物质运往药室腔的直接通道

在绝大多数植物中球形或马蹄形的乌氏体是分泌性绒粘层细胞的标志，早在1865年乌氏体就被Rosanoff发现[10]，但对于其功能的研究至今尚不清楚，有人认为乌氏体只是绒粘层代谢的副产物，但也有人证明乌氏体参与到胞粉素、脂肪酸衍生复合物、以及苯丙酯类从绒粘层运输到花药外壁形成花药壁的过程[11]。由于结构太小，又和绒粘层细胞紧密结合，乌氏体一直不能被分离，所以其生化性质一直没能被研究，直到RAFTIN蛋白的发现以及编码基因功能研究才直接证明乌氏体的运输功能[12]。在小麦中RAFTIN蛋白存在于前乌氏体中，并且在乌氏体中聚集，最后转移到小孢子壁上参与外孢壁的形成。伴随着花药绒粘层的浓缩与降解过程，本研究发现前乌氏体到成熟乌氏体的发育过程中大量脂肪体分散在其周围，从而间接证明了乌氏体可能参与到营养物质从绒粘层到药室腔的运输。

3.3 角质层和外孢壁对花药起到保护作用

高等植物具有高效和有效的繁殖能力，在不断的进化过程中，形成了两道屏障，用以保护小孢子和花粉细胞抵御各种环境胁迫和生物压迫。首先是花药壁的四层细胞，特别是覆盖有角质层的外表皮；其次是由外孢壁构成的花粉外壁，在花粉释放后抵抗环境胁迫中起到重要的作用[13]。

角质层是覆盖在植物地上部分最表层的保护层，直接与外界环境接触。角质层由最外层的上表皮蜡质和角质组成，上表皮蜡质主要由可溶性的脂肪酸、烷烃、脂肪醇、酮类和酯类组成，作为连续的网状分布于植物体的最表面。角质主要由羟基脂肪酸聚合形成的不可溶性多聚酯组成。角质层的重要功能是降低通过植物表面的水分散失，此外，角质层还在防止紫外线辐射伤害、抵抗病虫害的侵入方面起重要作用，也有研究报道角质层的蜡质含量与花粉育性和其他农艺性状有关[14-15]。

4 小 结

在水稻花药不同发育时期，花药各组织细胞具有特定的发育进程，同时表现出与之相对应的精细结构，本研究通过解剖、石蜡切片、扫描电镜以及透射电镜分别在器官发育的关键时期从整体结构特征到细胞形态进行了详细的观察和描述，发现了绒毡层细胞、上表皮细胞以及乌氏体等多种细胞组织的超微结构特征，对花药的发育系统研究具有重要意义。

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UltrastructuralObservationsofRicePollenDevelopments

ZHENG Ling, XIAO Pei-cun, XIE Cong-jian, CAO Hou-ming, ZHAO Peng, CHEN Yong*

(Hybrid Rice Research Center, Neijiang Academy of Agricultural Science, Sichuan Neijiang 641000, China)

【Objective】The development of microspores directly affected the fertility of mature anthers, and it is critical important to carry out the systematic cytological study which reveals the structural characteristics of different developmental stages.【Method】In combination with morphology observation and light microscope analysis, by using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) observation, an extensively cytological study of rice anther outer epidermis cutin layer and the internal cells was conducted on the pollen development of SI HUI 498, an indica cultivar. 【Result】(i) During pollen development process, ultrastructural change of tapetum was most dramatic: Tapetum cells had complete structure before meiosis; Following meiosis, tapetum cytoplasm condensed and vacuoles formed; The endoplasmic reticulums population rapidly increased and were clearly visible. These changes mean that endoplasmic reticulum may play a major role in the pollen development. (ii) From early vacuolated pollen stage, cell wall of anther outer epidermis gradually thickened, and finally cuticle formed protecting the microspore from various environmental and biological stresses. (iii)Orbicule, as nutrition direct access from tapetum cells to male gametophytes, was not visible until early spore pollen stage, participating in transportation of fatty acids and protein from tapetum cells. (iv)At the same time of orbicule formation, sporopollenins begin to deposit on the surface of spores and finally produced the structure of exine. 【Conclusion】Our results uncovered the cytological characteristics of anther development of several key development stages and found that the fine structure associated with their distinct functions in different tissues, which could guide the study of anther development.

Rice; Pollen development; Tapetum cells; Cuticle; Orbicule; Exine

1001-4829(2017)12-2624-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.002

2017-01-20

四川省十三五水稻育种攻关项目“引领性水稻育种材料与方法创新”(2016NYZ0028)

郑 灵(1986-) ，女，四川内江人，硕士，农艺师，主要从事分子生物辅助育种及优质多抗恢复系选育工作，Tel: 13890539812，E-mail: zl86311@163.com，*为通讯作者， E-mail: chengyongnj@163.com。

S511

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(责任编辑陈 虹)