提高新城疫LaSota株疫苗效价研究

杜海江

摘要 目前所生产的新城疫LaSota株疫苗的病毒效价仍有一定的提高空间，而病毒效价可极大地影响疫苗本身的质量。针对这一问题，本文利用正交试验原理，对影响疫苗效价的后孵化温度、后孵化湿度、照蛋时间间隔等3个因素进行试验设计。结果表明，温度为36 ℃、湿度为55%、照蛋间隔时间2 h为最佳生产方案，该方案能有效提高疫苗效价，从而提高疫苗的质量。

关键词 新城疫LaSota株；疫苗效价；后孵化温度；后孵化湿度；照蛋时间间隔

中图分类号 S852.4+3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）20-0213-02

新城疫LaSota株是副黏病毒属的一个代表病毒，直径为100～250 nm，有囊膜，通常呈圆形，但常因囊膜破损而变得不规则，也常见横断面100 nm左右的不同长度的细丝，呈现出多形性病毒粒子[1]，在10～12日龄鸡胚的绒毛尿囊膜或尿囊腔中生长，接种24～36 h病毒滴度可达到1010 EID50/mL。鸡胚经24～72 h死亡，出现血性病变和脑炎[2]。LaSota亦即L系苗，在新城疫弱毒疫苗中毒力最强，易感雏鸡，在接种后反应较重，一般不能用于2周龄以下的小鸡免疫[3]。试验发现，用哺乳动物细胞（如牛和猪的肾细胞）也可以培育此病毒，但病毒免疫原性差且滴度低于接种病毒。因此，鸡胚接种是目前最常用的方法。鸡胚苗中滴度>108 EID50/mL的可作活疫苗，滴度>107 EID50/mL的只可制作灭活苗，制成灭活苗明显降低了产品利润空间，再者疫苗滴度的高低也是疫苗质量好坏的一个重要指标。因此，如何提高疫苗滴度已成为亟待解决的问题[4]。本试验采用生物统计的方法对影响疫苗效价的后孵化温度、后孵化湿度、照蛋时间间隔等3个因素进行试验设计，得出最佳的生产方案，有效提高了疫苗的效价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种毒为新城疫LaSota株，由中国兽医药品监察所提供，生产前要先进行种毒继代，但不要超过3代。SPF鸡蛋（无特定病原体鸡蛋）由SPF鸡舍生产。微量移液器（一道及八道）、微孔板（v型96°）、振荡器、孵化器由热电（上海）仪器有限公司生产。0.85%生理盐水、5%碘酊、阿氏液按《兽用生物制品规程》（2000版）有关规定制备。

1.2 试验方法

1.2.1 1%鸡血红细胞配制。消毒取血部位，用一次性5 mL注射器抽取健康公鸡的翅下静脉血，抽3只，每只抽3 mL，然后加入等量阿氏液中混合均匀，用生理盐水洗涤3次，转速1 500 r/min，离心5 min，每次洗涤后吸弃上清液，包括红细胞上的白细胞层。最后用生理盐水配成1%鸡血红细胞（1 mL鸡血细胞加99 mL生理盐水）。

1.2.2 鸡胚前孵化。SPF蛋入孵前先用40～45 ℃含0.1%新洁尔灭的温水浸泡消毒，并用纱布擦拭鸡蛋表面，除去表面污物，同时挑除沙壳蛋、畸形蛋及破蛋。消毒好的蛋放入孵化器孵化（温度38℃，湿度65%），翻蛋次数10次/h。孵化5 d后一照，剔除无精蛋、破蛋及死胚蛋[5]。孵化10 d后二照，剔除死胚蛋并画蛋，在鸡胚胎面画出气室边缘线，在脐带或鸡头部周围避开大血管画出一小圆圈，即接种部位。

1.2.3 鸡胚接种及后孵。①接种。用0.1%新洁尔灭对10日龄鸡胚进行表面消毒，再用5%碘酊消毒接种部位，5 min后于接种部位打孔，同时将生产用种毒稀释5万～10万倍，在万级下局部百级的环境中进行接种操作：用带有5号针头的卡介苗注射器沿鸡胚长轴方向与蛋壳面成45°进针，每胚接种0.1 mL，接種后用蜡封住接种口。②后孵化。将接种完的1 881枚鸡胚随机分成9组，每组209枚，分别于以下不同试验条件下后孵化，具体如表1所示。

1.2.4 照蛋。接种60 h后按照不同时间间隔照蛋，将每一时期死亡胚体放入专用蛋盘，置于2～8 ℃中冷藏，96 h后的活胚待冷却后也放入2～8 ℃冷藏20 h。每组鸡胚分开放置，60 h以前的死胚弃去。

1.2.5 收苗。于缓冲间内用0.1%新洁尔灭擦拭鸡蛋表面，然后于万级下局部百级环境中用5%碘酊消毒气室周围，小心敲去气室周围蛋壳，不要弄破绒毛尿囊膜以免污染，用洁净注射器收取尿囊液，不要刺破卵黄，不收污染胚。收集每种试验方案的胚液，加入双抗（青霉素和庆大霉素）混匀，共9份。

1.2.6 测定病毒血凝价。每份尿囊液各取20 mL用于血凝试验，将待检样品分别用生理盐水稀释成1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700、1∶800、1∶900、1∶1 000，1∶1 100。其次用微量移液器依次从每个稀释度中移取30 μL到微孔板的第1～11孔中，第12孔加30 μL生理盐水作空白对照。摇匀鸡血红细胞，然后在每孔中各加入30 μL 1%鸡血红细胞（注意吸取量要准确，要悬空滴入以免拖带），并于振荡器上混匀2 min，最后水平静置于室温环境中，待空白对照孔发生完全沉集时读取血凝价，以50%凝聚孔的稀释度为该样品的血凝价，9组试验的血凝价见表2。

2 结果与分析

由表3、4可知，后孵化湿度对疫苗滴度影响最大，照蛋时间间隔次之，温度影响最小。最佳生产方式应该是后孵化湿度55%，照蛋时间间隔2 h，后孵化温度36 ℃。用该试验方案生产疫苗可使疫苗血凝价比原来（1∶256）高很多，并且可达到制作高效浓缩苗的标准。对9组死亡鸡胚进行胚体观察，发现大部分胚体都出现典型的出血病变，特别是喙部两侧、颈部、翅部边缘、脚部末梢等部位，小部分有脑炎症状。

3 结论与讨论

（1）本试验采用简便的血凝试验间接验证疫苗的滴度是可行的，因为新城疫病毒的HN蛋白能结合鸡血红细胞，血凝能力与病毒含量成正比[6]。血凝价反映的是病毒的含量，而鸡胚测毒反映的是活病毒含量。众多资料表明，血凝价与鸡胚测毒测出的滴度成正相关关系[7]。

（2）经查阅相关生产记录发现，新城疫病毒在高温高湿并且没有活细胞可供生长繁殖的条件下，病毒的自身降解速度很快。因此，缩短照蛋时间间隔可及时将死胚挑出，放置在干燥低温环境中，能较好保护病毒的稳定性。若后孵化湿度较低，胚体中的水分会有部分蒸发，有浓缩病毒的效果，但这样会导致胚液量的减少，可能会影响胚液收获量。笔者采用生物统计学中的方差分析法得出的结论与相关生产记录相符，但还有一些问题如种毒的稀释倍数调节、蛋的死亡时间控制等有待进一步研究和解决[8]，从而提高疫苗的效价。

（3）试验发现，接种后72 h的死胚及接种后96 h的活胚的血凝价比其他时段死胚的血凝价高，其中原理尚不明确。针对鸡胚接种后鸡胚的生长及病毒的繁殖规律等问题还需作进一步研究。

（4）本次试验仅从后孵化温度、后孵化湿度、照蛋时间间隔等3个因素对提高疫苗效价从而提高疫苗的质量进行初步探索，深层次的论证试验有待今后进一步进行。

4 参考文献

[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：736-750.

[2] 蔡寶祥.家畜传染病学[M].4版.北京：中国农业出版社，2005：304-309.

[3] 哈尔滨兽医研究所，中国农业科学院.动物微生物学[M].北京：中国农业出版社，1998：415-417.

[4] 李慧姣，蒋桃珍，李启红，等.鸡新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验与血清学（HI）试验的平行关系研究[J].中国兽医杂志，2004（8）：5-8.

[5] 李康然.鸡新城疫免疫中存在的一些问题[C]//中国畜牧兽医学会禽病学分会第八次学术讨论会论文集.青岛：中国畜牧兽医学会禽病学分会，1996：67-70.

[6] 陈一兵.非典型新城疫的发生机理与对策[J].养禽与禽病防治，1999（2）：13-14.

[7] 中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年版）[A/OL].（2014-12-24）[2018-05-21].https：//wenku.baidu.com/view/8e65ef92c8d376eeaeaa31ba.html.

[8] 刘国英，刘飞，郑向阳，等.鸡新城疫常规免疫接种途径的血凝抗体监测实验[C]//中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十二次学术研讨会论文集.广州：中国畜牧兽医学会生物制品学分会，2005.