miR-373-3p低表达慢病毒载体构建及其对子宫内膜癌细胞增殖迁移的抑制作用

李美仪，徐红，谭飞非

(广西医科大学第一附属医院，南宁530022)

miR-373-3p低表达慢病毒载体构建及其对子宫内膜癌细胞增殖迁移的抑制作用

李美仪，徐红，谭飞非

(广西医科大学第一附属医院，南宁530022)

目的构建人miR-373-3p低表达慢病毒载体，探讨miR-373-3p低表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖和迁移能力的影响。方法利用PCR扩增包含miR-373-3p前体序列的目的基因，经酶切后克隆入慢病毒载体GV280中构建GV280-pre-miR-373-3p inhibitor表达载体，通过与包装质粒共转染 293T 细胞，进行慢病毒的包装和滴度测定。分别用空载慢病毒(空载病毒组)及重组慢病毒miR-373-3p(miR-373-3p组)感染HEC-1A细胞，并设立空白对照组。采用RT-PCR法检测细胞miR-373-3p mRNA的相对表达水平，CCK-8法检测培养24、48、72、96 h时细胞增殖活力，细胞划痕和Transwell小室试验检测培养24、48 h时细胞迁移能力。结果成功构建了人miR-373-3p低表达慢病毒载体。与空白对照组和空载病毒组比较，miR-373-3p组miR-373-3p相对表达量低，培养48、72、 96 h HEC-1A细胞增殖活力均降低 (P均<0.05)，24、48 h HEC-1A细胞划痕面积迁移率低， 24 h穿膜细胞数少(P均<0.05)。 空载病毒组及空白对照组各指标比较，P均>0.05。结论成功构建了人miR-373-3p低表达慢病毒载体，miR-373-3p低表达可抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖、迁移能力。

子宫内膜癌；HEC-1A细胞；微小RNA;miRNA-373-3p；慢病毒载体；细胞增殖；细胞迁移

子宫内膜癌是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率较高， 严重威胁女性生命健康[1]。目前子宫内膜癌的治疗以手术为主, 但临床预后差，5年生存率低,寻找有效的早期诊断指标成为肿瘤治疗的热点。microRNA(miRNA)是生物体内一段长18～25 nt非编码小分子单链RNA，通过与目的基因mRNA 的3′端特异性地碱基配对,引起目的 mRNA 的直接降解或抑制其翻译，从而对基因转录后的表达发挥重要调控作用[2]。研究结果表明，miRNA参与多种肿瘤的转移形成过程[3]。miR-373最早由Voorhoeve提出，在睾丸精原细胞瘤作为癌基因被发现[4]。miR-373在乳腺癌、食管癌、神经胶质瘤、T细胞淋巴瘤等肿瘤中均有异常表达，与癌细胞的增殖、侵袭和转移密切相关[5～8]，但是有关miR-373在子宫内膜癌中的作用尚未见报道。2016年9月～2017年6月，本实验通过构建具有抑制作用的miR-373-3p慢病毒载体，观察miR-373-3p低表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖和迁移的影响,为进一步研究miR-373-3p在人子宫内膜癌细胞HEC-1A中的机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1．1 材料 293T细胞株、人子宫内膜癌HEC-1A细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)； 感受态细胞DH5α(天根生化科技有限公司)；慢病毒载体GV280和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0 (上海吉凯基因公司)；T4DNA连接酶、限制性内切酶AgeI、EcoRI (NEB 公司)；TaqDNA聚合酶( Vazyme公司)，DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(QIAGEN 公司)；Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)；TRIzol试剂、荧光定量PCR试剂盒(Takara公司)；CCK-8(日本同仁公司)；胎牛血清、DMEM高糖培养基(Gibco公司)。

1.2 miR-373-3p目的片段的扩增 根据miRBase数据库提供的has-miR-373-3p基因序列(MIMAT0000726)，使用Primer5.0 软件设计人pre-miRNA-373-3p inhibitor的PCR引物，引物由上海吉凯基因技术有限公司合成。上游引物(含AgeI 酶切序列)：5′-AATTCAAAAAGAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3′,下游引物(含EcoRI 酶切序列)：5′-CCGGACACCCCAAAATCGAAGCACTTCTTTTTg-3′,以含有目的序列的DNA 为模板进行扩增。PCR反应条件:98 ℃ 5 min、98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s，30 个循环; 72 ℃ 延伸 8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收目的基因片段。

1.3 miR-373-3p慢病毒表达载体的构建及鉴定 将纯化回收的 PCR 产物经AgeI 和EcoRI双酶切后再次回收获得 pre-miRNA-373-3p inhibitor片段，与线性化载体 GV280以2∶1摩尔比例使用T4连接酶4 ℃连接过夜，连接产物转化感受态细胞大肠埃希菌 DH5α，挑选的克隆菌落经PCR鉴定为阳性克隆转化子后进行DNA测序鉴定。序列正确的重组慢病毒载体命名为 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor。

1.4 重组慢病毒的包装和滴度测定 胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以细胞密度为5×106/15 mL接种于10 cm2细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，24 h待细胞密度达 70%～80% 时转染。将慢病毒表达质粒和 pHelper1.0、pHelper2. 0包装质粒在Lipofectamine 2000作用下共转染293T细胞，培养6 h换液，转染48 h后收集细胞上清液，4 ℃、4 000×g 离心 10 min，除去细胞碎片，经过滤纯化后分装冻存于-80 ℃备用。采用荧光法测定病毒滴度。取对数生长期293T细胞接种于96孔板，每孔4×104个，将慢病毒原液呈10的倍数稀释成10个阶梯后感染细胞。72 h后观察绿色荧光的表达情况，根据细胞荧光表达情况计算病毒滴度。计算公式：病毒滴度(Tu/mL)=荧光细胞数 / 病毒原液量。

1.5 HEC-1A细胞miR-373-3p表达水平检测 采用RT-PCR法。将HEC-1A细胞悬液按1×105/孔接种于6孔板中，次日待细胞融合度达30%时，将重组慢病毒(miR-373-3p组)及相应空载慢病毒(空载病毒组)以感染复数(MOI)30感染HEC-1A 细胞，并设立空白对照组，加入5 μL/mL ploybrene增强感染，培养12 h 更换新鲜培养基。72 h后通过荧光显微镜观察荧光表达情况判断感染效率。收集各组细胞，使用 TRIzol 法提取细胞总RNA，按 miRNA 逆转录试剂盒说明书将其反转录成 cDNA。以U6为内参，RT-PCR循环参数：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，重复 40个循环。用 2-ΔΔCt法计算各组miR-373-3p相对表达量。

1.6 HEC-1A细胞增殖活力的检测 采用CCK-8法。取对数生长期稳定转染的HEC-1A细胞，胰酶消化接种于96孔板,每孔种约3 000个细胞(100 μL)，设置空白对照组、空载病毒组和miR-373-3p组，每组设5个复孔。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，分别于转染24、48、72、96 h向各孔中加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃下孵育1 h,使用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的光密度(OD值),并绘制细胞生长曲线。

1.7 HEC-1A细胞迁移能力的检测 采用细胞划痕和Transwell小室试验。细胞划痕试验：取HEC-1A细胞消化后按5×104/孔接种于96孔板中。过夜后, 用枪头比着直尺垂直划线，用PBS冲洗2遍后, 加入无血清培养基。分别于0、24、48 h显微镜下拍照观察细胞迁移情况。采用image-Pro plus 6.0软件测量图片划痕区域的像素并定量分析划痕面积迁移率，划痕面积迁移率=(24、48 h划痕区域像素-0 h划痕区域像素)/0 h划痕区域像素。Transwell小室：收集转染miR-373-3p后的细胞,以1×104/ 孔接种于Tranwell小孔中。小孔上室加入无血清培养基的细胞悬液200 μL,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基600 μL。培养24 h后用棉签轻轻擦去小孔上室内细胞,甲醇固定30 min,0.1%结晶紫染色30 min。显微镜下随机观察5个200倍视野并计数细胞。

2 结果

2.1 慢病毒表达载体测序鉴定 重组慢病毒质粒经 PCR 及测序鉴定，DNA测序结果表明插入的目的片段与miRBase中的序列一致，证实GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor慢病毒表达载体构建成功。

2.2 慢病毒滴度及慢病毒感染HEC-1A细胞的效率 慢病毒三质粒系统共转染 293T 细胞，48 h后荧光显微镜下观察 293T 细胞可见GFP绿色荧光。慢病毒 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor病毒滴度约 6×108TU/mL，空载慢病毒滴度约4×108TU/mL。用重组慢病毒和相应空载病毒感染 HEC-1A细胞72 h后，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光表达情况，转染效率达85%以上。慢病毒成功感染目标细胞。

2.3 各组miR-373-3p的表达 空白对照组、空载病毒组、miR-373-3p组的miR-373-3p相对表达量分别为1.0±0.04、1.12±0.22、0.28±0.08。与空白对照组和空载病毒组相比，miR-373-3p组分别下降72%和75%(P均<0.05)，而空白对照组和空载病毒组比较，P>0.05。

2.4 各组HEC-1A细胞增殖活力比较 与空白对照组和空载病毒组相比, miR-373-3p组在培养48、72、 96 h细胞增殖活力均降低 (P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间细胞增殖活力比较

2.5 各组细胞迁移能力比较 转染24 h后，空白对照组、空载病毒组、miR-373-3p组HEC-1A细胞划痕面积迁移率分别为0.19±0.22、0.23±0.01、0.09±0.01，48 h后分别为 0.32±0.03、0.34±0.03、0.16±0.07。24、48 h HEC-1A细胞划痕面积迁移率低于空白对照组和空载病毒组(P均>0.05)，而空白对照组与空载病毒组比较，P>0.05。空白对照组、空载病毒组、miR-373-3p组穿膜细胞数分别为(79.3±10.50)、(84.7±12.06)、(48.3±9.07)个/HP, 24 h后 miR-373-3p组穿膜细胞数少于空白对照组、空载病毒组 (P均<0.05) , 空白对照组与空载病毒组比较，P>0.05。

3讨论

miRNAs 是一类内源性非编码小分子RNA片段，在基因表达过程中发挥重要的分子调节作用，参与细胞分化、细胞增殖、细胞调亡及血管生成等生理病理过程[9～11]。越来越多的研究发现，miRNA 在肿瘤的发生发展过程中起重要调控作用，并与肿瘤的进程密切相关。

miR-373是 miRNAs-371-372-373家族的成员之一，位于染色质19q13.42上，作为癌基因或者抑癌基因，在多种肿瘤如乳腺癌、食管癌、神经胶质瘤、T细胞淋巴瘤等组织中异常表达，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[5～8]。研究表明，miR-373在食管癌组织高表达，通过下调基质金属蛋白酶抑制剂TIMP3水平促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[6]。在舌鳞状细胞癌的研究中也发现，miR-373-3p通过抑制DKK1激活Wnt/B蛋白级联信号通道，诱导上皮间充质转化从而促进了肿瘤转移[12]。在胰腺癌中，血清中miR-373低表达与临床预后不良显著相关，且miR-373的表达水平与肿瘤分级、分期、远处转移密切相关，因此miR-373可能作为新的预测肿瘤的有效标记物和肿瘤治疗的潜在靶点[13]。miR-373也可作为抑癌的miRNA，Zhang等[14]发现，miR-373作用于Rab22a减弱卵巢癌的侵袭和转移能力，从而发挥了抑癌基因的作用。miR-373能下调功能靶点CD44 与 TGFBR2 的表达发挥抑制胶质瘤细胞U251 迁移与侵袭作用，抑制胶质瘤的发生[15]。多项研究表明，miR-373的异常表达影响肿瘤的发生发展，但是有关miR-373和子宫内膜癌的关系尚无报道。

我们前期研究用miRNA杂交芯片对子宫内膜组织进行检测，并采用qRT-PCR验证，发现子宫内膜癌组织miR-373的表达较正常子宫内膜组织明显升高，提示miR-373可能是癌基因，与子宫内膜癌的发生发展关系密切。为了研究miR-373在子宫内膜癌的作用，本实验通过脂质体共转染的方法构建低表达miR-373-3p的慢病毒载体，经双酶切鉴定和DNA测序检测正确后进行慢病毒包装及滴度测定。将构建成功的miR-373-3p慢病毒感染HEC-1A细胞，经 RT-qPCR检测感染后细胞中miR-373-3p表达量明显下降，经细胞生物功能检测显示, 低表达miR-373-3p明显抑制了HEC-1A细胞的增殖和迁移能力。

综上所述，本研究构建的miR-373-3p低表达慢病毒载体能够成功抑制子宫内膜癌miR-373-3p的表达，低表达miR-373-3p的HEC-1A细胞增殖和迁移能力明显受到抑制，为进一步研究miR-373-3p在子宫内膜癌细胞中的作用机制以及探索miR-373可能作为新靶点治疗子宫内膜癌的临床新方法奠定实验基础。

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ConstructionofmiR-373-3plentiviralvectorwithlowexpressionanditseffectonproliferationandmigrationofendometrialcancercelllineHEC-1A

LIMeiyi,XUHong,TANFeifei

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector of human miR-373-3p with low expression and to explore its effects on the proliferation and migration of endometrial carcinoma cell line HEC-1A.MethodsPCR was used to amplify the target gene containing pre-miR-373-3p sequence, and we cloned it into GV280 vector with restriction enzymes to construct the GV280-pre-miR-373-3p inhibitor expression plasmid which was co-transfected with packaging plasmid into 293T cells. After viral packaging, the titer of virus was detected. Empty lentivirus (empty virus group) and recombinant lentivirus harboring miR-373-3p (miR-373-3p group) were employed to infect human HEC-1A cells, respectively, and the control group was set up. RT-PCR was used to determine the expression of miR-373-3p in HEC-1A cells. The cell proliferation was measured by CCK-8 assay at 24, 48, 72, and 96 h after culture, and the cell migration was detected by Scratch test and Transwell assay at 24 and 48 h.ResultsHuman miR-373-3p entiviral vector with lower expression was constructed successfully. Compared with the empty virus group and control group, the expression of miR-373-3p in the HEC-1A cells decreased, and cell migration decreased at 48, 72, and 96 h in the miR- 73-3p group (allP<0.05); HEC-1A cell scratch area mobility decreased, and the number of transmembrane cells decreased at 24 and 48 h (allP<0.05). No significant difference was found in the above parameters between the empty virus group and the control group (allP<0.05).ConclusionThe lentiviral vector containing miR-373-3p with low expression is successfully constructed, and low expression of miR-373-3p inhibits the cell proliferation and migration of endometrial cancer cells HEC-1A.

endometrial carcinoma; HEC-1A cells; microRNA; miRNA-373-3p; lentiviral vector; cell proliferation; cell migration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.006

R737.33

A

1002-266X(2017)45-0020-04

广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目(S201520)。

李美仪(1990-)，女，在读硕士，主要研究方向为妇科肿瘤的基础研究。E-mail:1096234457@qq.com

徐红(1961-)，女，主任医师，主要研究方向为妇科疾病和妇科肿瘤诊治。E-mail:nnxuhong@163.com

2017-09-19)