超声波辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖及其抗氧化研究

陈文娟，陈建福，吴丽敏，庄远红

（1.漳州城市职业学院食品工程系，福建漳州 363000；2.漳州职业技术学院食品与生物工程系，福建漳州 363000；3.福建省精细化工应用技术协同创新中心，福建漳州 363000；4.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000）

超声波辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖及其抗氧化研究

陈文娟1，陈建福2，3*，吴丽敏4，庄远红4

（1.漳州城市职业学院食品工程系，福建漳州 363000；2.漳州职业技术学院食品与生物工程系，福建漳州 363000；3.福建省精细化工应用技术协同创新中心，福建漳州 363000；4.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000）

【目的】通过响应面法优化超声辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖的工艺，评价多糖的抗氧化活性。【方法】在单因素试验的基础上，以多糖提取率为响应值，选择酶用量、超声温度、超声时间和液料比进行Box-Behnken试验设计，研究了各工艺条件及其交互作用对扫帚菜多糖提取率的影响，得到了二次多项式回归方程模型，并以猪油的抗氧化性能来评价多糖的抗氧化活性。【结果】扫帚菜多糖的最佳提取工艺条件为：酶用量2.1%、超声温度51℃、超声时间20 min、液料比25 mL/g，该条件下扫帚菜多糖的提取率为65.93 mg/g，与理论预测值的相对误差为0.21%。扫帚菜多糖对猪油有一定的抗氧化能力。【结论】利用响应面法优化超声辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖的工艺有效、可靠，扫帚菜多糖能有效提高猪油产品的货架期。

超声辅助；纤维素酶；扫帚菜；多糖；抗氧化

扫帚菜（Kochia scoparia（Linn.）Schrad），又名地肤、地麦、落帚，为藜科一年生草本植物，在我国各处的荒地、路旁、田边、村落及庭院内均有分布，资源十分丰富[1]。扫帚菜含有多种天然有效成分如黄酮、多酚、多糖等，具有清热解毒、养心安神等功效，是一种营养价值很高的“药食同源”的保健性野菜[2]。然而目前对扫帚菜多糖的提取工艺研究的报道还较少。扫帚菜多糖主要存在于扫帚菜的组织细胞内，难于溶出，纤维素酶可以有效地水解扫帚菜细胞壁上的纤维素，增加细胞内容物进出细胞壁的通透性，且纤维素酶水解过程无毒，反应条件温和、催化活力可调控，是一种高效的辅助提取方法[3]。超声波是利用空化、机械和热效应等来产生扩散、搅拌等作用来提高溶剂进出细胞壁的穿透性，从而避免高温对提取物生物活性的破坏[4]。因此，采用超声波辅助纤维酶法提取，可以在低温环境下加速扫帚菜多糖的溶出，具有提取率高且省时、节能的特点。本文对超声波辅助纤维素酶法提取扫帚菜多糖的工艺进行响应面优化，建立扫帚菜多糖提取的新方法，并研究其扫帚菜多糖对猪油的抗氧化能力，以期为扫帚菜多糖资源的进一步开发与利用提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

扫帚菜：采于漳州市马鞍山；纤维素酶，食品级（5万U/g），郑州万搏化工产品有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-100DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LGJ10-C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 扫帚菜多糖的提取工艺

将采摘的新鲜扫帚菜嫩叶洗净，并进行冷冻干燥，粉碎，备用。后取1 g样品按文献[5]进行脱脂脱色干燥，后置于烧瓶中，加入0.02 g的纤维素酶，25 mL的蒸馏水，在50℃的超声波清洗器中超声回流20 min，回流结束后，按文献[5]进行除蛋白及定容，测试，含量测完后，进行醇沉，烘干，得扫帚菜多糖。

1.3.2 多糖含量的测定

扫帚菜多糖含量按文献[5]方法进行测定，多糖的提取率由下式计算：

1.3.3 抗氧化能力测试

在6个150 mL的烧杯中，各加入50 g的猪油，再分别加入 0、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%的扫帚菜多糖和0.05%的特丁基对苯二酚（TBHQ），按文献[6]方法进行抗氧化能力测试。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

扫帚菜多糖的提取主要考察5个单因素（加酶量、超声温度、超声时间、超声功率和液料比对多糖提取率的影响，每个因素做3次平行实验，取平均值。

1.4.2 响应面实验设计

响应面实验设计根据Box-Behnken实验设计原理，在单因素实验的基础上，以扫帚菜多糖提取率为指标，设计酶用量（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和液料比（D）4因素3水平共29个实验，各因素与水平编码如表1。

表1 因素与水平编码表Table 1 Code table of factors and levels'

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量的影响

固定超声温度50℃，超声时间20 min，超声功率90 W，液料比25 mL/g，考察酶用量分别1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时对多糖提取率的影响，如图1所示。由图1可知，在酶用量为2.0%时，扫帚菜多糖提取率达到最大值65.89 mg/g。这是由于酶用量的增加，促进了纤维素酶与底物的接触，使得扫帚菜颗粒细胞壁的破损，增加了细胞膜的通透性，使得多糖更容易溶出，而当酶用量过大时，会造成扫帚菜颗粒被包裹在纤维素酶里面[7-8]，而无法使得多糖进入溶剂中，造成了多糖提取率的下降，因此酶用量选择为2.0%。

图1 酶用量对多糖提取率的影响Figure 1 Effects of cellulase amount on extraction yield of polysaccharides

2.1.2 超声温度的影响

固定酶用量2.0%，超声时间20 min，超声功率90 W，液料比25 mL/g，考察超声温度分别为40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃时对多糖提取率的影响，如图2所示。由图2可知，在超声温度为50℃时，扫帚菜多糖提取率达到最大值65.89 mg/g，超声温度大于50℃时，扫帚菜多糖提取率又开始下降，而超声温度超过60℃后，提取率又开始增加，在70℃时出现了极大值57.24 mg/g。这是由于随着温度的升高，纤维素酶的活力增加，加快了酶与底物的作用，使得多糖更容易地溶出。而当温度超过50℃时，纤维素酶活力下降，而使得多糖提取率下降。但当超声温度超过60℃时，随着温度的升高，加快溶剂与扫帚菜颗粒的碰撞与破坏，促进了多糖的溶出[9]，而超声温度超过70℃，温度太高，部分耐热性差的多糖会发生分解[10]，使得多糖提取率下降，因此超声温度选择为50℃。

图2 超声温度对多糖提取率的影响Figure 2 Effects of ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharides

2.1.3 超声时间的影响

固定酶用量2.0%，超声温度50℃，超声功率90 W，液料比 25 mL/g，考察超声时间分别 10、15、20、25、30 min时对多糖提取率的影响，如图3所示。由图3可知，在超声时间为20 min时，扫帚菜多糖提取率达到最大值65.89 mg/g。这是由于超声时间的增加，增加了扫帚菜颗粒与溶剂的作用时间，使得多糖溶出更加充分，而超声时间过长时，部分多糖结构会受到破坏[11]，使得多糖提取率下降。因此超声时间选择为20 min。

图3 超声时间对多糖提取率的影响Figure 3 Effects of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharides

2.1.4 超声功率的影响

固定酶用量2.0%，超声温度50℃，超声时间20 min，液料比 25 mL/g，考察超声功率分别 60、70、80、90、100 W时对多糖提取率的影响，如图4所示。由图4可知，在超声功率90 W时，扫帚菜多糖提取率达到最大值65.89 mg/g。这是由于超声功率的增加，增大了超声的空化及机械搅拌作用，促进了多糖的溶出，而超声功率过大时，容易造成提取系统局部瞬时过热，从而造成多糖分子链的断裂，因此超声功率选择为90 W。

图4 超声功率对多糖提取率的影响Figure 4 Effects of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

2.1.5 料液比的影响

固定酶用量2.0%，超声温度50℃，超声时间20 min，超声功率90 W，考察液料比分别15、20、25、30、35 mL/g时对多糖提取率的影响，如图5所示。由图5可知，在液料比为25 mL/g时，扫帚菜多糖提取率达到最大值65.89 mg/g。这是由于液料比的增大，增加了提取体系的溶剂量，使得扫帚菜颗粒与多糖间的浓度梯度增加，促进了多糖的溶出，而当溶剂量过大时，扫帚菜颗粒会溶出更多的杂质参与多糖溶出竞争[12]，使得多糖提取率的下降，因此液料比选择为25 mL/g。

图5 液料比对多糖提取率的影响Figure 5 Effects of liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides

2.2 超声辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖工艺

2.2.1 回归模型

根据DesignExpert8.05b软件中的Box-Benhnken实验设计原理，在单因素的基础上，以扫帚菜多糖提取率为响应值，设计了酶用量（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和液料比（D）四因素三水平的响应面分析实验。具体实验方案如表2所示，分析结果如表3所示。

表2 Box-Benhnken实验设计及结果Table 2 Box-Benhnken design and result

续表（2）

表3 回归模型的分析结果Table 3 Analysis results of regression

根据表2的实验结果，进行分析，得到酶用量（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和液料比（D）对扫帚菜多糖提取率（Y）的四元二次回归方程：

从回归模型的方差分析结果（表3）中可以看出，该回归方程F=15.33，P＜0.000 1，回归方程极显著；回归模型的相关系数R2=0.938 8，说明有93%以上的数据可以用该模型来描述响应值的变化。而失拟项 F=5.07，P=0.065 7＞0.05，不显著，说明该回归方程对实验的真实值拟合情况好，综上分析，利用该模型方程来对实验真实点进行分析与预测是可靠的。回归方程中一次项 A、B、D，交互项 BC、BD，二次项 A2、B2、C2、D2对多糖提取率影响极显著；一次项C，对多糖提取率影响显著；交互项AB、AC、AD、CD对多糖提取率影响不显著，说明酶用量、超声温度、超声时间和液料比等工艺与多糖提取率之间不是简单的线性关系。方差分析表中的F值及P值可以看出，影响扫帚菜多糖提取率的因子主次顺序为：B>D>A>C，即超声温度＞液料比＞酶用量＞超声时间。

2.2.2 响应面分析

通过Design-Expert 8.05b软件绘制了响应面和等高线图，如图6～图11所示。图中反映了酶用量、超声温度、超声时间和液料比4个因素中任意2个因素取零水平时，剩下两因素之间的交互作用对扫帚菜多糖提取率的影响程度。

由图6可知，酶用量和超声温度交互作用不显著，扫帚菜多糖随着酶用量的增加和超声温度的升高均出现先增大后减小的趋势。

由图7可知，液料比和超声温度交互作用不显著，扫帚菜多糖提取率随着液料比的增加和超声温度的升高均出现先增大后减小的趋势。

由图8可知，酶用量和液料比的交互作用不显著，扫帚菜多糖提取率随着酶用量的增加和液料比的增大均出现先增加后减小的趋势。

由图9可知，超声温度和超声时间交互作用显著，表现为当超声温度较小时，超声时间对提取率的影响较大，最初随着超声温度的升高，扫帚菜多糖提取率迅速增大，而后随着超声温度的升高反而又开始下降。

由图10可知，超声温度和液料比交互作用显著，表现为当超声温度较小时，液料比对扫帚菜多糖的提取率影响较大，最初随着超声温度的升高，扫帚菜多糖提取率迅速增大，而后随着超声温度的升高反而又开始下降。

由图11可知，超声时间和液料比交互作用不显著，扫帚菜多糖提取率随着超声时间的延长和液料比的增大均出现先增加后减小的趋势。

2.2.3 最佳工艺及验证实验

图6 酶用量和超声温度对多糖提取率的影响Figure 6 Effects of cellulase amount and ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharides

图7 酶用量和超声时间对多糖提取率的影响Figure 7 Effects of cellulase amount and ultrasonic time on extraction yield of polysaccharides

图8 酶用量和液料比对多糖提取率的影响Figure 8 Effects of cellulase amount and liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides

图9 超声温度和超声时间对多糖提取率的影响Figure 9 Effects of ultrasonic temperature and time on extraction yield of polysaccharides

图10 超声温度和液料比对多糖提取率的影响Figure 10 Effects of ultrasonic temperature and liquid-material ratio on extraction yield of polysaccharides

根据Design Expert 8.05b软件对实验结果的分析，得到超声波辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖的最佳工艺条件为：酶用量2.11%，超声温度50.81℃、超声时间20.47 min和液料比25.55 mL/g，此时扫帚菜多糖的预测提取率为66.07 mg/g。考虑到实验的易操作性，将工艺条件修正为：酶用量2.1%、超声温度51℃、超声时间20 min、液料比25 mL/g，在修正后的工艺条件下进行3次平行验证实验，得到扫帚菜多糖提取率的平均值为65.93 mg/g，与理论预测值的相对误差为0.21%，说明该模型有效，准确性好，因此利用响应面对扫帚菜多糖的提取工艺进行预测与分析具有一定的应用意义。

2.4 扫帚菜多糖对猪油的抗氧化作用

考察了不同浓度的扫帚菜多糖和TBHQ对猪油的抗氧化作用如图12所示，从图中可以看出，随着强行氧化时间的增加，猪油的过氧化值逐渐增大，与空白样品相比，扫帚多糖和TBHQ对猪油均表现出一定的抗氧化作用，并且随着扫帚菜多糖用量的增加，抗氧化能力增强，当扫帚菜多糖添加量为0.05%时，其抗氧化能力略小于添加量为0.05%的TBHQ的抗氧化能力，继续增加扫帚菜多糖的用量到0.10%时，其抗氧化能力超过了添加量为0.05%的TBHQ的抗氧化能力，说明扫帚菜多糖能有效地提高猪油产品的货架期。

图12 多糖对猪油的抗氧化作用Figure 12 Antioxidation of polysaccharide on lard

3 讨论与结论

植物多糖提取的常用方法有溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体法和酶辅助提取法。不同的提取方法均有各自的优缺点，另外由于植物的种类或植物体的不同部位，导致在实际的多糖提取操作中，需要根据具体的情况来采用不同工艺或不同的工艺参数。徐珂等[13]利用超声波和纤维素酶进行协同提取杏鲍菇多糖，研究发现该方法的多糖提取率是传统的水提法的1.92倍；黎英等[14]利用超声波辅助复合酶法对红腰豆多糖的工艺进行了优化，研究发现该方法的多糖提取率比采用传统热水醇沉法提取率增加了111.5%，且提取时间缩短了31.1%，提取温度降低了20℃。可见采用超声波辅助纤维酶法提取，可以在较低温环境下加速扫帚菜多糖的溶出，具有提取率高且省时、高效、节能、环保的特点[15]。本文利用超声波辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖，在单因素的基础上，利用响应面法对提取工艺进行了优化，建立了扫帚菜多糖提取的四元二次方程，经三次平行实验验证了该方程的有效、准确，能够较好地预测扫帚菜多糖的提取率。超声波辅助纤维素酶提取扫帚菜多糖的最佳工艺为：酶用量2.1%、超声温度51℃、超声时间20 min和液料比25 mL/g，该条件下多糖的提取率为65.93 mg/g，与理论预测值的相对误差为0.21%，说明该模型有效，准确性好。扫帚菜对猪油具有良好的抗氧化能力，当扫帚菜多糖添加量为0.05%时，其抗氧化能力略小于添加量为0.05%的TBHQ的抗氧化能力，扫帚菜多糖能有效地提高猪油产品的货架期，该研究为扫帚菜的开发与利用提供应用基础。

［1］邵荣杰，邵世宏.地肤的各药用部位药用价值研究进展［J］.中草药，2015，46（23）：3605-3610.

［2］姚玉霞，蔡建培，李泽鸿，等.四种山野菜营养成分分析［J］.营养学报，2003，25（4）:441-442.

［3］QIAN Z G.Cellulase-assisted extraction of polysaccharides from Cucurbita moschata and their antibacterial activity［J］.Carbohydrate Polymers，2014，101（1）：432-434.

［4］LIAO J，QU B，LIU D，et al.New method to enhance the extraction yield of rutin from Sophora japonica using a novel ultrasonic extraction system by determining optimum ultrasonic frequency［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2015，27（12）：110-116.

［5］陈文娟，陈建福.超声辅助提取血柚皮多糖工艺优化及其对自由基的清除作用［J］.南京师大学报（自然科学版），2014（1）:141-146.

［6］陈文娟，陈建福.血柚皮多糖的碱法提取及其抗氧化活性研究［J］.中央民族大学学报（自然科学版），2014，23（3）:22-27.

［7］WANG H B.Cellulase-assisted extraction and antibacterial activity of polysaccharides from the dandelion Taraxacum officinale［J］.Carbohydrate Polymers，2014，103（3）：140-142.

［8］PAN S，WU S.Cellulase-assisted extraction and antioxidant activity of the polysaccharides from garlic［J］.Carbohydrate Polymers，2014，111（10）：606-609.

［9］LI C，FU X，HUANG Q，et al.Ultrasonic extraction and structural identification of polysaccharides from Prunella vulgaris and its antioxidant and antiproliferative activities［J］.European Food Research and Technology，2015，240（1）：49-60.

［10］HU J，JIA X，FANG X，et al.Ultrasonic extraction，antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2016，85（4）：277-284.

［11］LIU Y，QIANG M，SUN Z，et al.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from Hovenia dulcis peduncles and their antioxidant potential［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2015，80（9）：350-357.

［12］WU Z，LI H，YANG Y，et al.Ultrasonic extraction optimization of L.macranthoides polysaccharides and its physicochemicalprop erties［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2015，74（3）：224-231.

［13］徐珂，柯乐芹，肖建中，等.杏鲍菇多糖超声辅助酶法提取条件优化［J］.浙江农业学报，2015，27（4）：647-651.

［14］黎英，陈雪梅，严月萍，等.超声波辅助酶法提取红腰豆多糖工艺优化［J］.农业工程学报，2015，31（15）：293-301.

［15］LIU J，WILLFOR S，XU C.A review of bioactive plant polysaccharides：Biologicalactivities，functionalization，andbiomedical applications［J］.Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre，2015，5（1）：31-61.

Optimization of Ultrasonic-assisted Cellulase Extraction and Antioxidant Activity on Polysaccharides from Kochia Scoparia(Linn.)Schrad

CHEN Wen-juan1，CHEN Jian-fu2，3*，WU Li-min4，ZHUANG Yuan-hong4
（1.Department of Food Engineering，Zhangzhou City University，Zhangzhou 363000，Fujian，China；2.Department of Food and Biology Engineering，Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000，Fujian，China；3.Collaborative Innovation Center of Fine Chemicals in Fujian Province，Zhangzhou 363000，Fujian，China；4.Department of Biological Science and Technology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000，Fujian，China）

【Objective】The aim of the study was to optimize the ultrasonic-assisted cellulase extracting technology of polysaccharides from Kochia Scoparia（Linn.）Schradbyresponsesurfacemethodologyand to evaluate the antioxidative activity of polysaccharides.【Method】Based on a single factor experiment，a quadratic polynomial regression model was established about the dependent variable（extraction yield of polysaccharide）and independent variables（cellulase amount，ultrasonic temperature，ultrasonic time and liquid-material ratio），using Box-Benhnken design and response surface methodology.The antioxidant properties of lard were used to evaluate the antioxidative activity of polysaccharides.【Results】The optimum process parameters of ultrasonic-assisted cellulase extraction of polysaccharides from Kochia Scoparia（Linn.）Schrad were shown as followed，cellulase amount 2.1%，ultrasonic temperature 51℃，ultrasonic time 20 min and liquid-material ratio 25 mL/g.Under the optimal process conditions，the yield of polysaccharide was 65.93 mg/g and the relative error was 0.21%compared to the predictive value，indicating that the feasible model fitted well with the experimental data.The polysaccharides had a certain antioxidant capacity on the lard.【Conclusion】The ultrasonic-assisted cellulase extracting technology of polysaccharides from Kochia Scoparia（Linn.）Schrad by response surface methodology was effective and reliable.The polysaccharides could effectively improve the shelf life of lard.

ultrasonic-assisted；cellulase；Kochia Scoparia（Linn.）Schrad；polysaccharides；antioxidant activity

TS202；TQ91；S647 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2017）02-0172-08

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.006

2017-01-05

福建省中青年教师教育科研项目（JAT160915）；福建省高校杰出青年科研人才培育计划（闽教科[2015]54号）。

陈文娟，讲师，硕士。*责任作者：陈建福，副教授，博士，研究方向：天然产物化学工艺，E-mail：qjf1996@163.com。

（本文审稿：鲍立宁；责任编辑：巩艳红；英文编辑：徐振锋）