P16、Stathmin-1及Ki67在宫颈上皮内瘤变中的表达与意义

张晴 李丹 岳欣 朱菡 黄馨逸 王旭波(通讯作者)

221000南京中医药大学附属徐州市中医院病理科

P16、Stathmin-1及Ki67在宫颈上皮内瘤变中的表达与意义

张晴 李丹 岳欣 朱菡 黄馨逸 王旭波(通讯作者)

221000南京中医药大学附属徐州市中医院病理科

目的：探讨P16、Stathmin-1、Ki67在宫颈上皮内瘤变中的表达与临床意义。方法：收治宫颈病变患者92例作为观察组，选择20例慢性宫颈炎标本作为对照组，均检测P16、Stathmin-1、Ki67表达情况。结果：对照组P16、Stathmin-1及Ki67的阳性率显著低于观察组(P＜0.05)。直线相关性显示，P16、Stathmin-1及Ki67表达都呈现两两正向相关性(P＜0.05)。结论：P16、Stathmin-1和Ki67在不同级别的宫颈上皮内瘤变的病理诊断中有重要意义。

免疫组化技术；P16；Stathmin-1；Ki67；子宫颈上皮内瘤变

宫颈癌是妇科肿瘤中的第二大恶性肿瘤，是由宫颈上皮内瘤变(CIN)渐进性发展的一种肿瘤。CINⅠ在临床上以随访为主，CINⅡ、CINⅢ临床上则需要积极地手术治疗。我们通常把常规病理诊断认作是“金标准”，但是，因为缺乏客观依据，而且受到病理科医师自身及彼此之间的可变性的因素影响，对宫颈鳞状上皮病变的病理学诊断很大程度上会出现偏差，可导致临床漏诊或者过度治疗。因此，为了提高宫颈病变诊断的准确性，使用有效的生物学标记物为组织病理学诊断提供客观依据就显得尤为重要[1-4]。而P16、Stathmin-1、Ki67在宫颈病变的过程中可以作用于细胞的周期，并参与细胞的增殖、分裂及肿瘤生成的过程，在临床医学中具有较高的应用价值。2015年10月-2017年5月收治宫颈上皮内瘤变患者92例作为研究对象，探讨宫颈内皮上皮瘤变p16、Stathmin-1及Ki67的表达情况，并分析其临床诊断价值，现报告如下。

资料与方法

对2015年10月-2017年5月于我院就诊的首次行宫颈活检手术的92例(观察组)宫颈上皮内瘤变患者行石蜡组织包埋，并且排除子宫次全切除后、既往有子宫疾病病史诊疗后的患者。患者年龄20～74岁，平均36.67岁。其中，CINⅠ32例，CINⅡ30例，CINⅢ30例。选所有的切片均由资历较深的两名病理医师共同阅片。慢性宫颈炎20例作为对照组。

检测方法：所有标本均用10%的中性甲醛固定，常规进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，然后连续4 μm厚度切片，行HE染色，在奥林巴斯CX31光学显微镜下进行组织形态学观察，确定病理诊断及分组。P16、Stathmin-1和Ki67检测采用免疫组织化学SP法，实验操作严格地按照试剂盒说明书进行，以已知阳性片分别做P16、Stathmin-1和Ki67阳性对照染色，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照染色。其中鼠抗人P16单克隆抗体、鼠抗人Stathmin-1单克隆抗体、鼠抗人Ki67单克隆抗体及SP法试剂盒等均为福州迈新生物技术开发公司生产。

判定标准：用光学显微镜观察显色反应，在高倍镜下(×400)对每一张切片随机选择具有代表性的5个视野，并且每个视野计数200个细胞，一共计数1 000个细胞，然后计算每张切片阳性细胞数所占的百分比。①P16蛋白表达：细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，见图1。②Stathmin-1蛋白表达：细胞质内见到棕黄色颗粒为阳性，见图2。③Ki67表达：细胞核内出现棕黄色颗粒阳性，见图3。④按照阳性细胞百分比的多少分4级：无阳性细胞(-)为0～10%，弱阳性(+)为10%～25%，中度阳性(++)，25%～50%，＞50%强阳性(+++)。

统计学方法：采取SPSS 13.0分析，以Spearman相关分析比较患者P16、Stathmin-1及Ki67的表达关系，运用秩和检验统计P16、Stathmin-1及Ki67在宫颈上皮内瘤变中的表达差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各种不同病变组织中P16和Ki67的表达：P16蛋白在对照组的阳性率为20%，显著低于观察组(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)68.0%、100%及100%，差异有统计学意义(P＜0.05)。阳性表达强度结果显示：CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明P16的表达强度随着病变的加重呈正相关。Stathmin-1蛋白在对照组的阳性率30%，显著低于观察组(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)71%、93%及96%，差异有统计学意义(P＜0.05)。阳性表达强度上CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明Stathmin-1的表达强度随着病变的加重呈正相关。Ki67表达水平检测结果显示，Ki67在对照组的阳性率30%，显著低于观察组(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)78%、96%及100%，差异有统计学意义(P＜0.05)。CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明Ki67的表达强度与病变的加重呈正相关，见表1。

P16、Stathmin-1及Ki67三者间的关联性：3种抗体在宫颈组织中的表达结果经Spearman相关分析，P16阳性表达在慢性宫颈炎和CIN之间呈正相关(r=0.785，P＜0.05)；Stathmin-1阳性表达在慢性宫颈炎和CIN之间呈正相关(r=0.719，P＜0.05)；Ki67阳性表达慢性宫颈炎和CIN之间呈正相关(r=0.683，P＜0.05)。

表1 P16、Stathmin-1及Ki67在宫颈各型病变中的表达(n)

图1 P16在CINⅡ的表达(SPx100)

图2 Stathmin-1在CINⅡ的表达(SPx100)

图3 Ki67在CINⅡ的表达(SPx100)

讨 论

宫颈癌是妇科最常见得恶性肿瘤之一，其发病率有逐年上升及年轻化的趋势，其中多数为鳞状细胞癌，多数人认为宫颈癌的发生与性生活过早、多产、多个性伴侣及HPV感染等因素有关[5]。但是宫颈癌的发展过程时间比较长，病变的发展过程为长期慢性宫颈炎-宫颈上皮内瘤变-原位癌-浸润癌，尤其是癌前病变，病理上根据异型增生的细胞累及的宫颈鳞状上皮的层次，分为CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ。针对癌前病变进行及时、准确的分析，有利于预防与控制宫颈癌的发生。

P16基因是直接参与细胞周期调控的抑癌基因，P16基因的失活可使得宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱，从而启动了一系列的癌变过程。P16基因定位于细胞核内，属于抑癌基因，编码产物是16KD的蛋白，是作用于细胞分裂周期关键酶之一的CDK4的抑制因子，可以抑制细胞增殖和肿瘤发生。本组资料显示，CIN组中P16阳性表达率明显高于正常对照组，差异有统计学意义；P16在宫颈CINⅡ及CINⅢ组阳性表达率明显高于宫颈CINⅠ组，差异有统计学意义。此结果与顾依群等的报道相近[6]，数据表明P16的表达随着宫颈病变的级别上升而表达强度增强，与既往研究结果一致[7，8]，是宫颈上皮内瘤变病理诊断的很好的补充[9]，有效提高了对早期宫颈病变进展的预测效果，从而可以对这部分患者进行密切监测及早期干预治疗。

Stathmin-1是一种微管解聚蛋白，调节微管动力和纺锤体的形成，影响细胞的有丝分裂，从而改变细胞周期分布，影响细胞的生物学行为。Brooke等研究证实Stathmin-1在宫颈上皮内瘤变高表达，且与病变级别相关[10]。本研究中Stathmin-1在慢性宫颈炎中的阳性表达率30%，在CINⅠ中的阳性表达率71%，在CINⅡ级中的阳性表达率93%，在CINⅢ级中的阳性表达率96%，总体阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.01)。本研究中CIN组织中Stathmin-1与P16蛋白表达有正相关性，与Howiitt等的报道一致[11]。所以Stathmin-1协同P16检测可提高宫颈上皮内病变的分级准确率。

Ki67是表达于增殖期细胞的核抗原，参与细胞周期的调控。Ki67主要用于判断细胞的增殖活性，可在除G0期外的活动周期(Gl、S、G2和有丝分裂期)中表达，被公认为是能够准确且可靠反映细胞增殖活性的客观指标。本研究中，Ki67在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ中的阳性表达率分别为30%、78%、96%、100%，且阳性的强度随着病变级别的升高而越来越强。Mimica等研究发现[12]，Ki67检测可预测hrHPV感染，且Ki67蛋白与CIN程度相关，在CINⅡ、CINⅢ中的表达更高，说明Ki-67检测是使CIN分类更准确的辅助方法。近些年来，有些学者在对CIN的研究中，发现P16和Ki67两种蛋白的表达在CIN病变中呈正相关[13]，提示宫颈肿瘤的发生是一个多基因突变的结果，并且提示P16和Ki67在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生、发展中具有协同作用，因此联合检测P16和Ki67，可作为CIN分级诊断的辅助方法。

综上所述，宫颈上皮内瘤变是多基因、多因素共同作用的结果，准确、客观地诊断宫颈肿瘤和分级对临床上进一步治疗以及预后评价是非常重要的。本研究结果显示，CIN组中联合检测P16、Stathmin-1和Ki-67，可以辅助CIN的病理诊断，提高CIN的诊断准确率，使诊断更加客观，为以后的治疗方案提供合理依据，进而可以减轻患者的精神及经济负担。美国阴道镜协会及CAP颁布的专家共识中提出，在判断宫颈高、低级别CIN中，P16被公认为是有诊断意义的标记，而Stathmin-1作为一个新的指标是否能单独作为诊断参考指标还有待进一步研究证实。

[1]Zhong PP,Li JF,Gu YQ,et al.p16 and Ki-67 expression improves the diagnosticaccuracy of cervical lesions but not predict persistent high risk human papillomavirus infection with CINⅠ[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):2979-2986.

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[11]Howitt BE,Nucci MR,Drapkin R,et al.Stathmin-1 Expressionasa ComplementtP16 Helps Identify High-grade Cervical Intraepithelia Neoplasia With Increased Specificity[J].The American Journal of Surgical Pathology,2013,37:89-97.

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Expression and significance of P16,Stathmin-1 and Ki67 in cervical intraepithelial neoplasia

Zhang Qing,Li Dan,Yue Xin,Zhu Xi,Huang Xinyi,Wang Xubo(Corresponding author)
Department of Pathology,the Traditional Chinese Medicine Hospital of Xuzhou City Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine 221000

Objective:To explore the expression and significance of P16,Stathmin-1 and Ki67 in cervical intraepithelial neoplasia.Methods:92 patients with cervical lesions were selected as the observation group.20 cases of chronic cervicitis specimens were selected as the control group.The expressions of P16,Stathmin-1 and Ki67 were detected.Results:The positive rates of P16,Stathmin-1 and Ki67 in the control group were significantly lower than those in the observation group(P＜0.05).Linear correlation showed that the expression of P16,Stathmin-1 and Ki67 showed positive correlation with each other(P＜0.05).Conclusion:P16,Stathmin-1 and Ki67 had important significance in the pathological diagnosis of different grades of cervical intraepithelial neoplasia.

Immunohistochemical technique;P16;Stathmin-1;Ki67;Cervical intraepithelial neoplasia

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.34.74