胃癌组织中HIF—1α、NDRG2表达与EMT的相关性

王仁香 欧霞娩 康马飞

[摘要] 目的 觀察正常胃组织、胃癌组织和淋巴结转移癌组织中的低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、N-myc下游调节基因2（NDRG2） 和上皮间质转化（EMT）相关蛋白的表达差异。 方法 采用免疫组化法检测正常胃组织、胃癌组织和淋巴结转移癌组织中的HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和 Twist的表达。 结果 正常胃组织内HIF-1α无表达，而NDRG2高表达，NDRG2与E-Cadherin表达无差异，而与Snail和Twist的表达有显著差异。胃癌组织中HIF-1α与NDRG2表达无显著差异，HIF-1α和NDRG2表达均与E-Cadherin表达无显著差异，但均与Snail 和Twist表达有显著差异。淋巴结转移癌组织中HIF-1α高表达，而NDRG2无表达，HIF-1α表达与E-Cadherin、Snail和Twist的表达均无显著差异。NDRG2与E-Cadherin、Snail和Twist的表达密切相关，而HIF-1α与E-Cadherin、Snail和Twist的表达无关。 结论 在胃癌淋巴结转移组织中HIF-1α高表达，而NDRG2无表达。NDRG2与E-Cadherin、Snail和Twist的关系最密切，而HIF-1α与E-Cadherin、Snail和Twist的表达无关，故HIF-1α影响EMT可能是通过抑制NDRG2表达而实现的。

[关键词] 胃肿瘤/胃癌；低氧诱导因子-1α；N-myc下游调节基因2；上皮间质转化；转移

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）28-0034-04

[Abstract] Objective To observe the difference in expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）， N-myc downstream regulatory gene 2（NDRG2） and epithelial-mesenchymal transition（EMT）-related proteins in normal gastric tissue， gastric cancer tissue and lymph node metastasis. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of HIF-1α， NDRG2， E-Cadherin， Snail and Twist in normal gastric， gastric and lymph node metastatic tissues. Results There was no expression of HIF-1α in normal gastric tissue， while NDRG2 was highly expressed. There was no difference in the expression of NDRG2 and E-Cadherin， but there was significant difference between the expression of Snail and Twist. There was no significant difference in the expression of HIF-1α and NDRG2 between gastric cancer tissues. The expressions of HIF-1α and NDRG2 were not significantly different from those of E-Cadherin， but were significantly different from those of Snail and Twist. HIF-1α was highly expressed in lymph node metastasis， while NDRG2 was not expressed. There was no significant difference between HIF-1α expression and E-Cadherin， Snail and Twist expression. NDRG2 was closely related to the expression of E-Cadherin， Snail and Twist， while HIF-1α was not associated with the expression of E-Cadherin， Snail and Twist. Conclusion HIF-1α is highly expressed in lymph node metastasis of gastric cancer， but NDRG2 has no expression. NDRG2 is most closely related to E-Cadherin， Snail and Twist， while HIF-1α is not related to the expression of E-Cadherin， Snail and Twist. Therefore， HIF-1α may affect EMT by inhibiting NDRG2 expression.

[Key words] Gastric neoplasms/Gastric cancer；Hypoxia-inducible factor-1α；N-myc downstream regulatory gene 2；Epithelial-mesenchymal transition；Metastasis

胃癌发病率在全球排第4位，70%发生在发展中国家，在亚洲，胃癌发病率排在第3位[1]。在中国，胃癌死亡率排在肺癌和肝癌后，居第3位[2]，即使是R0切除术后，1年、2年和3年的总生存率也分别只有89%、74%和63%[3]，肿瘤转移是胃癌根治性切除后死亡的主要原因。因此，阐明其转移机制非常有意义。有研究认为，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α）可能在肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用[4-6]。N-myc下游调节基因2（N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2）可能为一个抑癌基因，在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的抑制作用，胃癌组织中NDRG2表达缺失或下调可能参与肿瘤的发展[7-9]。目前，胃癌及胃癌淋巴结转移组织中HIF-1α与NDRG2 表达是否有相关性尚未见报道。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）参与了肿瘤恶性表型转化的启动过程，是肿瘤开始转移的关键步骤[10]。那么，胃癌转移与HIF-1α和NDRG2的关系如何？本研究观察了正常胃组织、胃癌组织和胃癌淋巴结转移组织中HIF-1α、NDRG2和EMT相关蛋白如E-Cadherin、Snail 及Twist等的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2014年10月～2016年6月收治的经组织学确诊的胃癌患者20例，年龄35～70岁，中位年龄56岁。

1.2 实验方法

采用免疫组化法，观察胃癌组织、癌转移的淋巴结组织和正常胃组织中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail 和Twist的表达情况 。

1.2.1 免疫组化 对常规石蜡包埋的组织切片进行脱蜡处理，然后进行修复，加一抗和二抗，DAB显色，苏木素复染和封片等步骤。然后按各指标的评价标准进行评价。

1.2.2 HIF-1α检测结果评价标准[11] HIF-1α 蛋白主要表达于胃癌细胞胞质和（或）胞核内，以半定量积分法来判断阳性结果：（1）按着色强度评分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；（2）每张切片随机选取10个高倍视野，每视野计数 100个胃腺上皮细胞，计算阳性细胞占同类细胞的百分数：无阳性细胞为 0 分，阳性细胞数<25%为1分，25%～50%为2 分，>50%为3分。将两项得分结果相乘：<2分为阴性，>2分为阳性。

1.2.3 NDRG2结果评价标准[12] 每张切片随机选择 10 个高倍视野进行判定，抗原染色最终评分综合了染色强度和染色细胞比例两项指标。将细胞染色强度分为不着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色并依次记为0分、1分、2分、3分；将染色细胞占计数细胞比例分为0分<5%、5%≤1分<25%、25%≤2分<50%、50%≤3分< 75%、4分≥75%。细胞阳性强度评分：染色强度评分×染色细胞比例评分，（-）为 0 分，（+）为 1～4分，（++）为5～8分，（+++）为9～12分。

1.2.4 E-Cadherin、Snail 和Twist的结果评价标准[13] E-Cadherin 表达于胞膜或胞质，呈黄色染色为阳性细胞，Twist 蛋白表达于细胞质，少数位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色为阳性细胞。每例切片随机选取10个高倍视野，以阳性细胞的百分比进行结果判定。E-Cadherin：阳性细胞百分比≥25% 为阳性；Twist：阳性细胞百分比≥5% 为阳性。Snail 染色以胞核或/和胞浆出现淡黄色至棕黄色为阳性细胞。细胞按染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分作半定量分析。染色强度以多数细胞呈现的染色特性计分，与背景着色相对比，0分：无染色；1分：弱阳性；2分：阳性；3分：强阳性。按着色细胞百分比，1分：1%～25%；2 分：26%～50%；3分： 51%～75%；4分：76%～100%。然后按阳性细胞×染色强弱计积分，积分1～2为阴性，积分3～12为阳性。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，两组间计数资料的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表达检测情况

HIF-1α在正常胃组织中不表达，在胃癌组织中有表达，淋巴结转移组织中表达更高。淋巴结转移癌组织中与胃癌组织中比较，HIF-1α表达有显著差异（χ2=4.395，P=0.037）。NDRG2在正常胃组织中高表达，阳性率达85%，而胃癌组织中表达明显下降，淋巴结转移癌组织中无表达。正常胃组织与胃癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达比较，有显著差异（χ2=30.179，P=0.000）。胃癌组织与淋巴结转移癌组织中的表达比较，有显著差异（P=0.047）。正常胃组织与胃癌组织和淋巴结转移组织中的表达比较，E-Cadherin表达有显著差异（χ2=12.217，P=0.000）；Snail表达无显著差异（χ2=3.811，P=0.051）；Twist表达有显著差異（χ2=15.372，P=0.000）。胃癌组织与淋巴结转移组织中的表达比较，E-Cadherin、Snail和Twist的表达均无显著差异（χ2分别为1.804、1.541和0.419，P值分别为0.179、 0.214和0.517）。见表1、封三图3～7。

2.2 同一组织内HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的关系

在正常胃组织中HIF-1α不表达，NDRG2高表达，与E-Cadherin表达无显著差异，与Snail 和Twist表达有显著差异。在胃癌组织中HIF-1α与NDRG2表达无显著差异（P=1.000）。HIF-1α和NDRG2表达均与E-Cadherin表达无显著差异，与Snail 和Twist表达有显著差异。在淋巴结转移组织中HIF-1α高表达，NDRG2不表达。HIF-1α表达与E-Cadherin、Snail 和Twist表达均无显著差异。见表2。

3 讨论

3.1 HIF-lα的作用

HIF-1是细胞在缺氧状态下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种重要的核转录调节因子，其在血管形成、细胞增殖、能量代谢、红细胞生成、细胞黏附等相关基因的调控方面均占很重要的地位。缺氧诱导因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亚单位构成的异二聚体。低氧可以通过HIF-lα诱导多种基因的表达，参与肿瘤的浸润转移。HIF-1α在细胞内水平的增高仅仅只是因为在缺氧或低糖的环境下HIF-1α的稳定性明显提高而在胞内积聚，当缺氧或低糖得到改善时，HIF-1α被迅速降解。肿瘤组织生长迅速，必然会处于缺氧状态而诱导HIF-1α表达，因此，癌基因的激活及抑癌基因的失活可导致瘤细胞中HIF-1α的表达升高及活性的增强。有研究认为，细胞外基质蛋白1通过整合素β4/FAK/SOX2/HIF-1α信号通路调节胃癌细胞转移和葡萄糖代谢[13]。

3.2 NDRG2的作用

NDRG2由李剑等[14]首次发现，NDRG2 在包括胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、前列腺癌在内的较多肿瘤中低表达[15，16]。NDRG2在正常胃组织中高表达，而在胃癌组织中低表達。在胃癌细胞SNU-620 中干预NDRG2的表达，能够促进胃癌细胞的增殖[17]，提示NDRG2可抑制胃癌的发生和发展。

3.3 EMT的作用

EMT主要的特征有细胞黏附分子，如E钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。转录因子：Snail因子表达上调可以作为EMT的生物标志物。Twist具有独立的抑制E-Cadherin表达并上调纤连蛋白和N钙黏蛋白的作用。EMT是肿瘤转化瀑布中重要的一步，在肿瘤迁移和侵袭过程中具有重要性。

3.4不同组织中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表达

本研究发现，HIF-1α 和NDRG2在正常胃组织、胃癌组织和淋巴结转移癌组织中的表达相反，即正常胃组织内HIF-1α无表达，而NDRG2高表达，在淋巴结转移癌组织中HIF-1α高表达，而NDRG2无表达。在上述3种组织中，HIF-1α或NDRG2表达均有显著差异，提示HIF-1α可能通过抑制NDRG2表达而促进胃癌发生、发展和转移。有学者利用HIF-1α单克隆抗体检测了HIF-1α在多种肿瘤中的表达，发现90%的结肠癌、乳腺癌及前列腺癌组织中HIF-1α表达升高，而在肿瘤附近正常组织中则不表达[18-20]。在本研究中，正常胃组织中NDRG2与E-Cadherin均高表达，胃癌和淋巴结癌组织中均低表达。E-cadherin可维持细胞间紧密连接，阻止细胞活动侵袭及转移扩散，NDRG2是否通过E-Cadherin起作用有待于进一步研究。Twist表达在上述组织中的表达相反，两者比较有统计学差异，而Snail表达无统计学差异，考虑Twist具有独立的抑制E-Cadherin表达而促进EMT的功能。有研究认为通过调节STAT3通路可调节胃肠癌的EMT，通过NDRG2抑制NDRG2/gp130/STAT3通路，下调Snail表达而抑制EMT，从而抑制肿瘤转移[21-23]，但在本研究结果中，NDRG2与Snail表达无显著差异，原因不明。

3.5 同一组织中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表达

已有学者证实HIF-1α在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为[24，25]。可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰或改变小RNA等改变各种信号通路，如TGF-β、PI3K、MAPK、Hedgehog 和Wnt等通路，从而控制EMT过程[26]。转录因子Grhl2可抑制TGF-β诱导的EMT，从而降低胃癌细胞的侵袭和迁移能力[27]。抑制Snail可抑制HIF-1α诱导的EMT[28，29]。在本研究中，正常胃组织中HIF-1α不表达，NDRG2高表达，NDRG2表达与Snail 和Twist表达有显著差异。在胃癌组织中HIF-1α和NDRG2均与Snail 和Twist表达有显著差异。在淋巴结转移癌组织中HIF-1α高表达，NDRG2不表达，HIF-1α表达与E-Cadherin、Snail 和Twist表达均无显著差异。提示NDRG2与E-Cadherin、Snail和Twist的关系最密切。而HIF-1α与E-Cadherin、Snail和Twist的表达无关，故可能的解释就是HIF-1α影响EMT是通过NDRG2而实现的。

总之，本研究结果显示，正常胃组织内HIF-1α无表达，而NDRG2高表达，在淋巴结转移癌组织中HIF-1α高表达，而NDRG2无表达。NDRG2与E-Cadherin、Snail和Twist的关系最密切，而HIF-1α与E-Cadherin、Snail和Twist的表达无关，故HIF-1α影响EMT可能是通过抑制NDRG2表达而实现的。

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（收稿日期：2018-05-21）