苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的抑制作用实验研究

徐志山 王洪一 钟黎明 回蔷 郭冰玉 陶凯

[摘要]目的：研究苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其相关作用机制。方法：通过收集手术切除的瘢痕疙瘩进行体外培养成纤维细胞，将细胞分为3组，分别加入10μmol/L，20μmol/L的苦参碱以及对照组（0.9% NaCl）进行实验。MTT实验检测细胞增殖情况；流式细胞技术进行细胞周期分析；Hoechest 33258染色检测细胞凋亡情况；Western blot实验检测苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡和自噬相关调控蛋白表达的影响。结果：通过不同浓度的苦参碱处理细胞后，MTT结果发现成纤维细胞的增殖受到抑制，抑制作用具有剂量依赖性；细胞周期分析发现，苦参碱作用后细胞的G1-S期转化受到了不同程度的抑制；Hoechest 33258染色发现苦参碱可以促进凋亡细胞的增加；Western blot实验结果发现苦参碱可以抑制CDK4、CDK6、Bcl-2和LC3-I蛋白的表达，促进Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达。结论：苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用，能够影响细胞增殖、凋亡和自噬相关调控蛋白的表达。

[关键词]苦参碱；成纤维细胞；增殖；凋亡；自噬；细胞周期；瘢痕疙瘩

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）10-0137-04

Abstract： Objective To study the effects of Matrine on the proliferation， apoptosis and autophagy of keloid fibroblasts in vitro and its related mechanisms. Methods The fibroblasts were cultured in vitro by collecting surgical excised keloids. The cells were divided into three groups and the 10μmol/L， 20μmol/L matrine and the control group （0.9% NaCl） were added to the experiment. MTT test was used to detect the proliferation of fibroblasts， flow cytometry was used for cell cycle analysis， Hoechest 33258 staining was used to detect cell apoptosis， Western blot was used to detect the effect of Matrine on the proliferation， apoptosis and autophagy related protein expression of keloid fibroblasts. Results After treating cells with different concentrations of matrine， MTT results showed that the proliferation of fibroblasts was inhibited and the inhibitory effect was dose-dependent. The cell cycle analysis showed that the G1-S phase transformation of the cells was inhibited in varying degrees after the action of matrine. Hoechest 33258 staining showed that matrine could lead to a significant increase in apoptosis. The results of Western blot showed that matrine could inhibit the expression of CDK4， CDK6， Bcl-2 and LC3-I protein， and promote the expression of Bax， LC3-Ⅱ and Beclin-1. Conclusion Matrine can inhibit the proliferation and promote apoptosis of keloid fibroblasts， and can affect the cell proliferation， apoptosis and the expression of autophagy related proteins.

Key words：Matrine； fibroblasts； proliferation； apoptosis； autophagy； cell cycle； keloid

瘢痕疙瘩（Keloid）是皮膚创伤后结缔组织过度增殖形成的良性肿块。其病理组织学特点是成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质过量的沉积。对于瘢痕疙瘩的治疗方法有很多，药物是瘢痕疙瘩预防和治疗的一大类别，包括抗代谢药、类固醇激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药等[1-2]。而寻找疗效确切、副作用小的药物，对于瘢痕疙瘩的预防和治疗具有重要临床意义。

苦参碱（Matrine，Mat）是从豆科植物苦参的干燥根、植株中提取得到的一种生物碱，归属于四环喹嗪啶类化合物[3]。目前已有报道[4]，苦参类生物碱具有多方面的药理活性及生物学功能。而我们常用的瘢痕软化膏的主要活性成分就是苦参类生物碱，其能够显著抑制瘢痕的增生，使增生性瘢痕软化缩小，临床效果显著。苦参碱在增生性瘢痕中的作用研究报道较多，但在瘢痕疙瘩中的作用却尚不十分清楚，而且对于苦参碱在瘢痕疙瘩中的作用机制，需要进一步研究。本次研究通过体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，利用不同浓度的苦参碱对细胞进行处理，研究苦参碱对细胞增殖、凋亡、自噬等生物功能的影响。希望通过本次实验能够为临床应用苦参碱预防和治疗瘢痕疙瘩提供依据。

1 材料和方法

1.1 标本和材料：收集了8例沈阳军区总医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩。其中男性3例，女性5例；年龄10～42岁；耳廓部位4例，下颌部2例，前胸部2例；瘢痕疙瘩取材标准：凸出于皮肤表面、无破溃和感染、且既往未经手术和激光等治疗。标本选取均获得患者的知情同意，并经过医院伦理委员会审批。苦参碱（中国药品生物制品检定所提供标准品，使用NaCl配制），四甲基偶氮唑藍[MTT，3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide]（Sigma，美国）、PI（Propidium Iodide）染料、Hoechest 33258染料（江苏碧云天生物技术公司，中国）；DMEM培养基（invitrogen，美国）；胎牛血清（天津灏洋生物制品有限公司，中国）；相关抗体：CDK4、CDK6、LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax和GAPDH（Santa，美国）。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞培养：采用组织贴壁细胞培养法进行成纤维细胞培养。将瘢痕疙瘩标本剪碎成0.5～1mm3的微粒，加入DMEM培养基（含10%胎牛血清、50IU/ml青霉素和50IU/ml链霉素），置于37℃、5% CO2培养箱中培养。当原代细胞成片生长后，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，然后进行传代培养。每3d更换新鲜培养基，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 MTT实验检测成纤维细胞增殖情况：将对数生长的成纤维细胞接种于96孔板内（浓度1×105/ml），终体积200μl进行培养。12h后更换培养基，分别加入10μmol/L，20μmol/L的苦参碱及0.9% NaCl作为对照，每组设3个复孔。于0、12、24、36和48h分别加入10μl的5mg/ml MTT溶液，37℃、5% CO2培养箱中孵育4h后弃去培养基，各孔中加入200μl DMSO。继续培养15min后，在490nm处记录OD值。

1.2.3 细胞周期分析：将对数生长期的细胞制成1×106/L浓度的细胞悬液接种于6孔板中，贴壁培养至密度达70%时，继续培养24h后PBS洗涤，胰酶进行消化成单细胞悬液。在4℃下用70%的冰乙醇固定1h，PI染液避光染色30min。流式细胞仪测定细胞周期所占百分比。

1.2.4 Hoechest 33258染色检测细胞凋亡情况：将成纤维细胞悬液（浓度1×106/L）接种于6孔板中，贴壁培养24h后，分别加入10μmol/L，20μmol/L的苦参碱及对照组0.9% NaCl。24h后每孔加入100μl Hoechest 33258孵育染色15min。用荧光显微镜10×20倍下观察细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot实验检测苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞CDK4、CDK6、LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax的蛋白表达的影响：将成纤维细胞悬液（浓度1×106/L）接种于6孔板中，贴壁培养24h后，分别加入10μmol/L，20μmol/L的苦参碱及对照组0.9% NaCl。24h后收集细胞，提取蛋白后每个加样孔上样40μg蛋白。SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h。TBST洗膜3次后孵育一抗4℃过夜。TBST再次洗膜3次，室温孵育二抗1h。漂洗后ECL发光仪发光。

1.2.6 统计学分析：重复实验3次，数据以均数±标准差（x?±s）表示。采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，使用非配对t检验比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响：采用10μmol/L，20μmol/L的苦参碱分别对瘢痕疙瘩成纤维细胞作用0h，12h，24h，36h和48h后，结果如图1所示：苦参碱可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，各组结果与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），苦参碱对细胞的增殖抑制作用与剂量和作用时间呈正相关。

2.2 不同处理组对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响：如图2所示，不同处理因素作用下，瘢痕疙瘩成纤维细胞的G1-S期转化受到了不同程度的抑制。浓度为10μmol/L的苦参碱处理细胞后，G1期和S期的细胞分别比例占59.32%和20.34%，而20μmol/L组的G1期和S期分别占66.15%和14.93%。相比于0.9% NaCl处理细胞后的S期25.93%明显减低。说明了当苦参碱的浓度越高时细胞周期G1-S期被阻滞的程度越明显。

2.3 不同浓度苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响：如图3所示，Hoechest 33258染色观察发现苦参碱能一定程度上诱导成纤维细胞的凋亡。相比对照组，当苦参碱浓度为10μmol/L时，细胞凋亡的数量增加；而浓度为20μmol/L时，细胞凋亡的数量增加更为明显。苦参碱浓度越高，诱导细胞凋亡的作用越明显。

2.4 不同处理组对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡、自噬相关蛋白的影响：在不同浓度的苦参碱作用下，调控增殖相关的蛋白CDK4和CDK6表达受到了影响，且苦参碱浓度增高，蛋白表达受到抑制更明显，表明苦参碱能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。见图4。

调控凋亡相关的蛋白Bcl-2和Bax表达也受到了影响。当苦参碱浓度增加时，抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达减少，而促凋亡相关蛋白Bax的表达明显增加。苦参碱能够影响凋亡相关蛋白表达，进而促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡。见图5。

在不同浓度的苦参碱作用下，调控自噬相关的蛋白LC3和Beclin-1表达受到了影响。当苦参碱浓度增加时，抗自噬相关蛋白LC3-I的表达减少，而促自噬相关蛋白LC3-II和Beclin-1的表达明显增加。苦参碱能够影响自噬相关蛋白表达，进而促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的自噬。见图6。

3 討论

瘢痕疙瘩是一种能够向周围正常组织呈蟹足样或哑铃状生长的肿块，无自愈倾向，也被认为是一种皮肤的“良性肿瘤”。瘢痕疙瘩中的成纤维细胞表达许多肿瘤有关的因子，有人提出瘢痕疙瘩的肿瘤源性学说[5-6]。苦参碱在肿瘤中的作用研究较多，其具有抑制细胞增殖、诱导分化的作用。而在瘢痕疙瘩中却较少研究，因此，本实验选取苦参碱为实验对象，研究其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、凋亡和自噬的生物功能的影响。

早有研究报道了苦参碱在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖而不引起细胞坏死性改变，对DNA含量无明显影响。成纤维细胞的过度增殖是瘢痕疙瘩形成和发展的重要原因，因此应用MTT实验检测了苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的调节作用。实验结果发现，苦参碱能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。研究发现[7-8]，苦参碱能够诱导前列腺癌、甲状腺癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞细胞周期的进程。在抗纤维化研究中发现[9-10]，苦参碱能够作用于肾纤维化、心肌纤维化，也能够对抗皮肤纤维化，抑制肝星状细胞的增殖，增加细胞的凋亡率。通过流式细胞技术检测发现，苦参碱能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞G1期向S期转化。成纤维细胞的凋亡在创伤后组织修复过程中也发挥重要作用，研究证明苦参碱处理可以促进成纤维细胞的凋亡数量的增加。

为了探索苦参碱抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的机制，本实验又通过Western blot实验检测苦参碱对细胞的增殖、凋亡和自噬相关蛋白的调节作用。实验检测发现了苦参碱能够抑制增殖相关蛋白CDK4和CDK6的蛋白表达。已有研究发现[11-12]苦参碱能够通过使凋亡相关调控蛋白Bax表达上调，p53、Bcl-2表达下调，促进兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡。实验发现，苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡作用具有剂量依赖性。当苦参碱浓度增加，抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达减少，而促凋亡相关蛋白Bax的表达明显增加。因此，苦参碱能够通过影响凋亡相关蛋白表达，进而促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡。研究已经发现，当细胞受到应激源刺激后，自噬相关蛋白LC3-I能够转变为LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体膜表面，是自噬体膜的特异性标志物，能够反映细胞自噬活动的强弱[13-14]。本次研究发现，经苦参碱处理后，成纤维细胞的Beclin-1和LC3-Ⅱ表达增加，说明苦参碱能够促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的自噬功能。

综上所述，苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用，能够影响细胞增殖、凋亡和自噬相关调控蛋白的表达，对瘢痕疙瘩的预防和治疗具有一定的生物学作用。

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[收稿日期]2018-07-09 [修回日期]2018-08-10

編辑/朱婉蓉