单/双指数模型DWI评估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化疗疗效的对比研究
2018-01-05邹乔余煜栋包盈莹万齐陈后金张焕贤李新春
邹乔， 余煜栋， 包盈莹， 万齐， 陈后金， 张焕贤， 李新春
·实验研究·
单/双指数模型DWI评估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化疗疗效的对比研究
邹乔， 余煜栋， 包盈莹， 万齐， 陈后金， 张焕贤， 李新春
目的探讨单、双指数模型DWI评估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化疗疗效的可行性和准确性，并筛选最佳参数。方法在48只雌性裸鼠中建立肺腺癌移植瘤模型，并将其随机分为治疗组A及对照组B，A组和B组分别采用腹腔内注射顺铂和生理盐水。每组各随机抽取4只裸鼠(AM组、BM组)于4个时间点(第0、3、7和10天)行体素内不相干运动成像(IVIM-DWI)，测量病灶的体积及表观扩散系数(ADC)、真实扩散系数(D)、灌注分数(f)和灌注相关扩散系数(D*)。两组各16只裸鼠(AP、BP组)分别在对应的4个时间点每次随机抽取4只进行病理学检查。比较各组不同时间点肿瘤体积和DWI参数值，并采用受试者工作特征曲线(ROC)分析各参数值的诊断效能。结果化疗第3、7、10天AM组肿瘤的ADC和D值较BM组明显升高，f值明显降低(P<0.05)。化疗第10天AM组肿瘤体积较BM组明显缩小(P<0.05)，而第3、7天肿瘤体积的差异无统计学意义(P>0.05)。治疗第3天各参数的ROC下面积依次是0.917(D)、0.833(ADC)和0.667(f)；以D值>1.02×10-3mm2/s作为阈值，敏感度和特异度分别为83.3%和100%；以ADC值>1.08×10-3mm2/s作为阈值，敏感度和特异度分别为66.7%和100%。病理检查显示，在化疗第3、7和10天时AP组肿瘤细胞坏死和出血较BP组明显增多，AP组微血管密度(MVD)及细胞增殖抗原67(Ki67)的表达水平随时间延长而下降，AP组与BP组间MVD及Ki67表达水平分别在第7、10天及第3、7、10天时差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺腺癌移植瘤化疗后D、ADC和f值的改变早于肿瘤体积的变化；D值对肺腺癌早期化疗疗效的评价可能优于ADC值。
肺腺癌； 体素内不相干运动； 扩散加权成像； 化疗； 早期疗效； 动物实验
目前对肺癌疗效的评估主要基于实体瘤疗效评价标准1.1(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)[1]，其实施方便、快捷，但存在随访时间长、存在一定的假阴性率等缺点。DWI作为一种可以检测活体组织细胞内外水分子微观运动的功能磁共振成像技术，可为肺癌的诊断及预后评估提供有价值的信息。文献报道，基于多b值的体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion，IVIM)DWI已经运用于临床研究中，且较单指数模型更有优势[2-3]，然而应用IVIM-DWI技术对肺癌化疗疗效进行评估的报道目前国内外较为少见。本研究前瞻性运用IVIM-DWI技术对顺铂治疗前后的裸鼠肺腺癌进行评估，分析单、双指数模型参数在监测肺腺癌早期化疗疗效中的可行性及准确性，旨在为临床准确评价肺癌化疗疗效提供参考。
材料与方法
1.动物选取及人肺腺癌A549细胞株的培养
Balb/c-nu雌性裸鼠48只(购自广东省医学实验动物中心，6～7周龄，20～22 g)饲养于广州市呼吸疾病研究所的SPF级动物房。人肺腺癌A549细胞株(由广州市呼吸疾病研究所赖克方教授课题组提供)置于加入10%胎牛血清的DMEM培养基中，在温度37℃、湿度95%的CO2细胞恒温培养箱中传代培养。
2.人肺腺癌细胞模型的建立及分组
人肺腺癌A549细胞悬液的浓度为2×107个/mL，分别接种于所有裸鼠左侧腹股沟皮下，0.1 mL/只，待肿瘤生长至短径达(1.0±0.2) cm时即为建模成功。成瘤裸鼠随机分为治疗组A和对照组B，每组24只。A组每3天向裸鼠腹腔内注射1次顺铂(购于江苏豪森药业股份有限公司)，浓度0.2 mg/mL，剂量4 mg/kg，共注射3次；B组则于相同时间点向裸鼠腹腔内注射等量生理盐水。A、B两组中各随机抽取8只裸鼠于注药的第0、3、7和10日行MRI检查，分别记为AM、BM组。两组中各剩余16只裸鼠分别记为AP、BP组，于上述4个时间点各随机选择4只裸鼠在处死后进行病理学检查。
3.MRI检查及图像后处理
使用Philip Achieva 3.0T多源超导型MR扫描仪。使用1%戊巴比妥钠溶液(剂量5 mL/kg)对AM、BM组裸鼠麻醉成功后，置于8通道腕关节线圈内(含自制分隔装置)。扫描序列和参数如下。①横轴面精确频率反转恢复序列(spectral presaturation attenuated inversion recovery)T2WI：TR 2410 ms，TE 70 ms，矩阵200×143，激励次数3；②冠状面T1WI：TR 3000 ms，TE 100 ms，矩阵172×126，激励次数3；③IVIM-DWI采用单次激发EPI和化学位移频率选择脉冲并SPAIR脂肪抑制技术：TR 758 ms，TE 54 ms，矩阵 64×58，b值11个(分别为0、20、40、60、80、100、200、400、600、800和1000 s/mm2)，激励次数8；所有序列视野60 mm×60 mm，层厚3.0 mm，层间距0.0 mm。
将IVIM-DWI扫描数据导入随机配置的IVIM后处理软件中，生成相应的DWI参数图，再使用Image J软件进行后处理，参照T2WI上病灶的位置，在最高b值DWI图像上于病灶内的高信号区勾画ROI，ROI尽可能包括整个肿瘤，不避开坏死及出血区，不同参数图上ROI的位置和大小尽量保持一致(图1)。测量的DWI参数包括病灶的表观扩散系数(ADC)、真实扩散系数(D)、灌注分数(f)和灌注相关扩散系数(D*)，每个参数测量3次记录其平均值。同时在T2WI上测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按公式(1)计算肿瘤的体积(volume，V)：
V=a×b2×π/6
(1)
4.病理学检查
将肿瘤标本常规石蜡包埋，4 μm连续切片，每份标本切片4张，常规行HE及免疫组化染色。免疫组化检查采用Envision两步法，肿瘤石蜡组织分别以CD34、Ki67鼠抗人单克隆抗体标记(均购于福州迈新生物技术开发有限公司)。微血管密度(microvessel density，MVD)计数采用Weidner技术，记录5个高倍视野内的微血管数量，取其平均值作为该张切片的微血管计数结果。Ki67以胞核中出现棕黄色颗粒为阳性判定标准，染色结果综合染色强度和阳性细胞数百分比进行半定量分析。染色强度以多数细胞呈现的染色特性计分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞百分比(positive rate，PR)为某类细胞在5个视野内的阳性细胞百分比的平均数：PR≤5%计0分，5%
5.统计学分析
表2 AM组与BM组不同时间点IVIM-DWI参数比较
注：*P<0.05，差异有统计学意义。
图1 肺腺癌皮下移植瘤。a) SPAIR T2WI，肿瘤呈明显高信号(箭)； b) DWI(b=1000s/mm2)，肿瘤呈明显高信号(箭)； c～f) 分别为生成的D、f、D*和ADC图，在相同位置全瘤划取ROI(红线)，不避开出血及坏死，分别获得相应的D、f、D*和ADC值。
结 果
1.肿瘤体积及IVIM-DWI参数组间及组内比较
四个时间点肿瘤体积的测量值及统计分析结果见表1。AM组和BM组间仅在化疗第10天时肿瘤体积的差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组(AM)中随着化疗时间的延长肿瘤体积表现为先增大后缩小，治疗后第3天肿瘤体积达峰值，而至第10天时体积达最小；不同时间点组内两两比较结果显示，治疗后第3天与第10天时肿瘤体积的差异有统计学意义(P=0.036<0.05)。对照组(BM)中随着时间的延长肿瘤体积缓慢增大，第10天时达高峰，且第0天与第10天时肿瘤体积的差异有统计学意义(P=0.035<0.05)。
表1 AM组和BM组在化疗后不同时间点的肿瘤体积
不同时间点两组中各参数的测量值及统计分析结果见表2、图2。化疗后第3、7、10天，AM组的ADC、D值较BM组明显升高，f值较BM组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。AM组中随着时间点延长ADC和D值缓慢升高，且与基线值(第0天)间的差异均有统计学意义(P值分别为0.000、0.003和0.000，P均<0.05)。BM组内ADC、D值在各时间点之间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.ADC与D、f值的ROC比较
图2 肺腺癌皮下移植瘤治疗组化疗第0、3、7和10天(1～4)时的SPAIR T2WI及ADC、D、f值的伪彩图。a1～a4) 为SPAIR T2WI，显示随时间延长肿瘤体积逐渐缩小；b1～b4) 为ADC图，显示随时间的延长肿瘤内坏死逐渐增多，扩散受限减轻，ADC值升高；c1～c4) 为D值图，显示随着时间的延长，肿瘤内坏死增多，D值升高(呈绿色)；d1～d4) 为ADC图，显示随着时间的延长肿瘤内血流灌注减少，f值降低(呈紫黑色)。
表3 不同时间点治疗组与对照组MVD及Ki67的比较
注：*P<0.05，两组间差异有统计学意义。
以化疗后第3天ADC、D和f值的变化绘制肺腺癌裸鼠顺铂化疗早期疗效的ROC曲线(图3)，曲线下面积依次是0.833、0.917和0.667。以D值>1.02×10-3mm2/s作为阈值，评估化疗早期疗效的敏感度和特异度分别为83.3%和100%；以ADC值>1.08×10-3mm2/s作为阈值，评估化疗早期疗效的敏感度和特异度分别为66.7%和100%；以f值<3.30%作为阈值，评估化疗早期疗效的敏感度和特异度分别50%和100%。
4.病理组织学改变
HE染色光镜下表现：AP组化疗后随着时间的延长肿瘤内坏死、出血增加，并于第10天时达高峰(图4)。BP组随着时间的延长，可见肿瘤细胞分布更密集，未见明确的坏死区域。
不同时间点组治疗组和对照组的免疫组化检查结果见表3和图5～6。化疗后第0和3天时AP组与BP组间MVD计数的差异无统计学意义(P>0.05)，化疗后第7和10天时AP组的MVD计数较BP组明显降低(F值均为，P<0.05)；化疗后第0天时AP组与BP组间Ki67表达水平间的差异无统计学意义(P>0.05)，化疗后第3、7和10天时AP组的Ki67表达水平均较BP组明显降低(F值分别为1.000、0.000和9.000，P均<0.05)；而AP组和BP组内MVD计数和Ki67表达水平在各时间点之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
图3 ROC曲线，显示ADC(黄色)、D(绿色)和f值(红色)的AUC依次为0.833、0.917和0.667。
图4 治疗组中不同时间点肿瘤的病理图(×200，HE)，显示随着治疗时间的延长，肿瘤组织内肿瘤细胞的密度降低，坏死、出血增多。a) 第0天； b) 第3天； c) 第7天； d) 第10天。 图5 治疗第10天MVD免疫组化染色，光镜下显示血管内皮细胞呈棕褐色，AP组微血管数明显少于BP组(×400)。a) AP组； b) BP组。图6 治疗第10天Ki67免疫组化染色，光镜下显示肿瘤细胞的胞核中出现棕黄色颗粒，AP组染色阳性的细胞数明显少于BP组(×400)。a) AP组； b) BP组。
讨 论
本研究采用11个b值的IVIM单/双指数模型，结果显示在化疗后第3天时治疗组的ADC和D值较对照组显著升高、f值较对照组明显降低，提示ADC、D和f值能够早期监测肿瘤化疗疗效，与Cui等[4]的研究结果基本一致。本研究中，在化疗后第7天时治疗组的MVD计数较对照组明显减低(P<0.05)，并且随着治疗时间的延长，治疗组中MVD计数进一步降低。在化疗后第3、7和10天时治疗组的Ki67表达水平较对照组明显降低(P<0.05)，并且随着治疗时间的延长而下降。本研究结果提示，IVIM参数的改变与病理学的改变基本一致。
据史红媛等[5]报道，裸鼠人肺腺癌模型在恩度治疗后第3天时，治疗组的ADC值明显高于对照组，判断化疗有效的ADC阈值为(0.79±0.03)×10-3mm2/s。本研究中，在化疗第3天时评价裸鼠肺腺癌化疗有效的ADC阈值为1.08×10-3mm2/s，低于史红媛等的报道，推测可能与化疗药物、扫描序列及场强等因素不同有关。
IVIM是基于双指数模型的DWI技术，近年来其在胰腺肿瘤、脑转移瘤和前列腺癌等疾病中的作用已经得到肯定[6-8]。本研究结果显示，D和f值对判断肺腺癌裸鼠化疗早期疗效具有一定价值。据Cui等[6]报道，荷人鼻咽癌裸鼠在采用易瑞沙二代zactima(ZD6474)治疗后第3天，治疗组中D值明显升高，与本组研究结果一致；但是该研究显示，在治疗后第1天时治疗组的f和D*值较对照组明显减低(P<0.05)，而本研究中，在化疗后第3天时治疗组与对照组间f值的才出现显著差异(预实验结果显示化疗后第1天时IVIM参数的组间及组内差异无统计学意义，故观察时间点未选择化疗后第1天)。上述不同研究间结果存在的差异及其意义，尚需要大样本的研究进行进一步验证。本研究中，D*值不能作为监测肺癌化疗疗效的有效指标，推测可能与D*值的可重复性较差[9]以及与其它研究中所采用动物模型的肿瘤类型、治疗药物不同等因素有关。
较多文献报道，对肿瘤形态学的监测不能准确评价早期化疗的疗效。Brahmer等[10]报道28例非小细胞肺癌患者在初次纳武单抗(Nivolumab)治疗后经RECIST 1.1标准判定为肿瘤进展，继续采用Nivolumab治疗后仍有9例患者能够继续获益。Park等[11]的研究亦证实，非小细胞肺癌患者在RECIST 1.1评估为肿瘤进展后继续应用厄洛替尼治疗，可将无进展生存时间再延长3.1个月[11]。本研究中，治疗组中随治疗时间的延长肿瘤体积呈现先增大(第3天达高峰)、后缩小的规律，组内比较，仅化疗后第3天与第10天时的肿瘤体积的差异具有统计学意义，余组内两两比较体积的差异均无统计学意义；对照组中肿瘤体积表现为随时间延长而缓慢增大，组内比较，仅在第0天与第10天时肿瘤体积的差异有统计学意义；而组间比较时，仅在化疗后第10天时肿瘤体积的差异有统计学意义，提示肿瘤体积出现差异的时间明显晚于DWI参数(ADC、D、f)值的改变，表明肿瘤在治疗后功能的改变早于形态学的改变，提示采用IVIM功能参数监测肺腺癌裸鼠化疗疗效要优于对体积的监测，可作为肺癌化疗疗效监测的可靠指标。
有文献报道，双指数模型DWI在疾病的诊断和随访过程中的价值比单指数模型更佳[12-13]。本研究结果显示，在化疗后第3天时以D值判别肿瘤治疗疗效的ROC曲线下面积最大，其次是ADC和f值，提示D值对评估肺腺癌裸鼠早期化疗疗效的诊断效能最高，亦提示双指数模型DWI对恶性肿瘤早期化疗疗效的监测价值优于单指数模型，与Xiao等[14]的观点一致。但是，双指数模型中各定量参数的诊断效能，在不同的研究间结果不尽相同[12, 15]，尚需大样本量的研究进一步证实。
总之，化疗后肺癌的IVIM-DWI参数值的变化早于肿瘤体积的变化，且这些参数值的变化规律与病理学改变基本一致，可作为预测肺癌化疗疗效的可靠的定量指标；双指数模型的D值对肺腺癌裸鼠早期化疗疗效的评价效能可能优于单指数模型的ADC值。
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Diffusion-weightedimagingformonitoringtheearlyresponseoflungadenocarcinomaxenograftinnudemousetochemotherapy：acomparativestudyofmonoexponentialandbiexponentialmodels
ZOU Qiao,YU Yu-dong,BAO Yin-ying,et al.
Department of Radiology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,China
Objective:To study the feasibility and accuracy of mono-exponential and bi-exponential models DWI for evaluating the curative effect of chemotherapy on lung adenocarcinoma xenograft in nude mice,and to select the optimal quantitative parameters.MethodsTransplantation tumor model of human lung adenocarcinoma was established in 48 female BALB/c nude mice,and the nude mice were randomly divided into two groups.In group A,cisplatin was administered by intraperitoneal injection,meanwhile the equivalent sterile saline was administered in group B.Four mice were selected randomly from group A and four in group B (named as AMand BMgroup),and IVIM-DWI scanning was performed immediately at baseline,3th,7th and 10th day,the DWI parameters including ADC,D,f and D*values and tumor volume were calculated.The rest of the 32 mice were randomly divided into APand BPgroup (n=16 for each),4 mice were selected randomly from APand BPgroup respectively to undergo pathology examination in different observation time.The changes of tumor volume and DWI parameters of different groups were compared at every time points.The receiver operating characteristic curve (ROC) was applied to significant parameters to compare the area under the curve and calculate their sensitivity and specifi-city.ResultsThe ADC and D values of tumor in AMgroup were significantly higher while f value was significantly lower than those in BMgroup at the 3th,7th and 10th day after chemotherapy (allP<0.05).In AMgroup,the tumor volume was significantly decreased than those of BMgroup at the 10th day (P<0.05).The area under curve was 0.917 for D,0.833 for ADC,0.667 for f value at the 3th day after treatment.When D value>1.02×10-3mm2/s,ADC value>1.08×10-3mm2/s,the corresponding sensitivity and specificity were 83.3% and 100%,66.7% and 100%,respectively.In APgroup the tumor necrosis and hemorrhage were significantly increased than those in BPgroup at the 3th,7th and 10th day,In APgroups,MVD value decreased and was significantly lower than those of BPgroups at the 7th and 10th day,while Ki67 at the 3th,7th and 10th day (P<0.05).ConclusionD,ADC and f value of subcutaneous transplantation tumor model of lung adenocarcinoma changed earlier than tumor volume after chemotherapy of lung cancer.The D value derived from biexponential may be superior to the ADC from monoexponential model in evaluating the efficacy of chemotherapy in nude mice.
Lung adenocarcinoma； Intravoxel incoherent motion； Diffusion-weighted imaging； Eearly therapeutic effect； Animal experiment
510120 广州，广州医科大学附属第一医院放射科(邹乔、余煜栋、包盈莹、万齐、李新春)，放疗科(张焕贤)；100044 北京，北京交通大学电子信息工程学院(陈后金)
邹乔(1988-)，男，新疆库尔勒人，硕士，住院医师，主要从事肿瘤影像诊断及磁共振功能成像工作。
李新春，E-mail：xinchunli@163.com
国家自然科学基金(81601457)；广东省医学科研基金项目(A2016410)；广州市科技计划项目(201510010234)；广州市医药卫生科技项目(20151A011066)
R445.2； R734.2
A
1000-0313(2017)12-1242-06
10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.12.008
2017-05-31
2017-09-04)
