烤烟烟叶烘烤中蛋白质的降解动态变化规律研究

王万能，项钢燎，翟羽晨，马扩彦，戴 亚，谭兰兰

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆 400060；3.四川中烟工业有限责任公司，四川 成都 610000)

烤烟烟叶烘烤中蛋白质的降解动态变化规律研究

王万能1，项钢燎1，翟羽晨1，马扩彦2，戴 亚2，谭兰兰3

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆 400060；3.四川中烟工业有限责任公司，四川 成都 610000)

为明确不同部位及不同烘烤时间段烟叶中蛋白质变化规律，利用SDS-PAGE电泳等实验技术，分析烟叶蛋白动态分布和变化特点。烟叶蛋白在不同的烘烤时间段的降解速度不同，在烘烤0～50 h烟叶蛋白质含量的降解速度快，从19%降至9%，烘烤后期趋于平缓。烟叶蛋白分子量分布在11.8～90.5 ku，上、中、下部叶片的蛋白存在明显差异，上部叶片中大、小分子量蛋白含量比中、下部叶片多，下部叶片中分子量蛋白含量较高。不同类别的蛋白在烟叶烘烤过程的不同阶段中降解规律不相同。

烟叶；蛋白质；SDS-PAGE；降解

烟草属于草本植物中的茄科类，蛋白质在烟草生长发育过程中对其生理生化过程具有重要意义，它在烟草生长发育过程中逐渐积累，采收后新鲜烟叶中的蛋白质在其烘烤调制过程中又逐渐减少[1-4]。品质好的烟叶在烘烤调制、储存之后其蛋白质多分解为分子量较小的短肽，或分解为氨基酸参与美拉德反应，积累烟叶的功效物质。过量的大分子蛋白质，会影响卷烟的质量，在品吸时会有难闻的焦油气味，燃烧性能不好，并且成品烟辛辣有毒、味苦涩，降低了烟草的安全性和香味品质[5-11]，而目前对烟叶内蛋白质的变化分布特点了解甚少。本试验运用SDS-PAGE电泳技术对不同部位和烘烤阶段烟叶的蛋白质变化情况进行研究，以准确了解不同部位的烟叶品质和生产用途，为改善烟叶烘烤工艺提升烤烟品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 烟叶样品

烤烟品种为红花大金元、K326，烟叶样品由重庆市武隆县巷口镇烟草生产基地提供，取烤烟烟株已成熟的新鲜上、中、下叶位叶片，置于烘箱中于105 ℃杀青30 min，采用重庆市三段六步式烘烤工艺，取烘烤过程中不同烘烤时间段叶片，皆用液氮保存。

1.1.2 实验药品

BCA蛋白质定量试剂盒(SIGMA-ALDRICH)、磷酸氢二钠(AR)、磷酸二氢钠(AR)、牛血清蛋白质(AR)、TCA(15%三氯乙酸水溶液)、PBS(磷酸缓冲液0.05 mol·L-1，pH 6～8)、SDS(美国Sigma公司)、四甲基乙二胺TEMED(美国AMRESCO公司)、过硫化铵(广州捷倍斯生物科技有限公司)、Tris(美国AMRESCO公司)。浓HCl、β-巯基乙醇、蔗糖、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、甲醇、冰乙酸、考马斯亮蓝R250、Tris酚、醋酸铵、丙酮、TEMED、甘氨酸等试剂均为成都市科龙化工试剂厂出品。

1.1.3 主要仪器

酶标仪(美国宝特Bio-Tek)，TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，ACCULAB型精密电子天平(精度0.0001 g)，超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)，梅特勒—托利多实验室pH计(FE20)，MP2002型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，XK-96A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(GelDocEZ,美国Bio-Rad公司)，SCIENTZ-IID型超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，冷冻真空干燥机。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质标准曲线的制作

用PBS将2 mg·mL-1标准牛血清蛋白母液配制成0、25、50、125、250、500 μg·mL-1系列标准工作溶液。将25 μL标准蛋白质工作溶液和200 μL BCA工作液，充分混匀，37 ℃水浴30 min，取出后快速冷却至室温，在波长为562 nm处用酶标仪测定标准溶液的吸光度值，并与对应的浓度进行线性回归，回归方程为：y=0.001x+0.089(y—吸光度，x—蛋白质浓度μg·mL-1)，R2=0.997>0.995， 测定浓度范围0～0.5 mg·mL-1，得标准蛋白质工作曲线。

1.2.2 烟叶中蛋白质含量的检测分析[12-13]

准确称取0.5 g粉末烟叶样品于玻璃匀浆器中，用适量PBS后研磨。将匀浆液于4 ℃条件下，以4 000 r·min-1离心5 min。将上清液用中速滤纸过滤，离心分离得到的残渣采用上述方法研磨、离心、过滤，重复上述操作2次。收集总过滤液用PBS定容至250 mL，得到样品液。

取所得样品液2 mL于10 mL离心管，加入3倍体积的PBS，混匀，标为1号待测液；另取上述所得的烟叶样品液2 mL于10 mL离心管，加3倍体积的15%TCA，混匀，于37 ℃水浴中孵育10 min，在20～25 ℃条件下以10 000 r·min-1，离心10 min，取上清液标为2号待测液。用BCA法在酶标仪上测定1号和2号待测液的吸光值，将差值代入标准蛋白质的回归曲线方程计算烟叶样品蛋白质的含量。

1.2.3 苯酚法提取烟叶总蛋白[14-15]

利用苯酚法提取烟叶中蛋白质，称取K326烟叶样品2.5 g，加入适量预冷的提取缓冲液(蔗糖150 g，SDS 7.5 g，用Tris-HCl(pH 8.8)定容至500 mL，用时加4%β-巯基乙醇)，在匀浆器中充分研磨后于涡旋振荡器上涡旋10 min充分混匀，冰浴超声波破碎细胞5 min，重复以上操作4次。加1.5～2.0倍体积的饱和Tris酚后，再次重复2次上述操作。静置分层，11 000 r·min-1，4 ℃离心25 min，另取10 mL的离心管备用，取上层酚相1.5 mL于离心管中，加5倍体积预冷的0.1 mol·L-1甲醇-醋酸铵(0.1 mol甲醇-醋酸铵，3.854 g醋酸铵，用甲醇定容至500 mL，含0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20 ℃下放置过夜。11 000 r·min-1，4 ℃，离心30 min，去上层清液，用预冷的含0.07% β-巯基乙醇的甲醇溶液洗涤沉淀。并用预冷的含0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液洗涤至上清液无色，-20 ℃下低温真空干燥，制成蛋白质样品干粉。在-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.4 SDS-PAGE电泳

烟叶蛋白样品干粉与蛋白裂解液(硫脲2 mol·L-1，尿素42%，CHAPS 4%，二硫苏糖醇65 mmol·L-1)1 mg∶30 μL的比例溶解，制成待分离样。配置15%分离胶，5%浓缩胶，厚度为1 mm的凝胶进行电泳。将Marker与待分离样品蛋白用2×蛋白染液按照1∶1的比例混匀，沸水浴中沸腾5 min，取出后10 000 r·min-1离心2～5 min，上样。起始电压80 V，当Marker到达分离胶后调至120 V，待最快的条带移到凝胶底板3/4时完成电泳。用考马斯亮蓝快速染色(R250)方法进行凝胶染色，脱色过夜，再用BIO-RAD扫描仪进行扫描[16]。

1.2.5 烟叶中蛋白动态变化规律分析

利用Image Lab软件对SDS-PAGE凝胶电泳图数据进行处理，条带编号数代表不同分子量的蛋白质，根据已知分子量大小的Marker条带，便可知样品条带相对于Marker的分子量大小，体积指的是该条带的蛋白质体积，而条带百分比是指每一个条带所占的整个的泳道所有条带的体积的百分占比，根据其大小可以知道对应的蛋白质的含量，分析不同烟叶样品中蛋白质分子量大小分布及不同分子量蛋白质含量的比例，由此明确不同部位或烘烤时间烟叶蛋白质的变化情况。

2 结果与分析

2.1 烟叶蛋白含量的变化规律

通过分析K322和红花大金元烟叶不同烘烤时间段蛋白质含量的变化可知，鲜烟叶的蛋白质含量最高，成熟鲜烟叶的蛋白质含量通常在20%左右，随着烘烤时间的增加，蛋白质会在烘烤过程中先快速降解再缓慢降解最后趋于平稳。由图1可以分析得出，烘烤时间每增加10 h，蛋白质的含量大约减少2.5%。直至烘烤到140 h的时候，烟叶的蛋白质含量降到最低点，大概为6%，与最先没有烘烤的烟叶的蛋白质的含量相比，大约降低至其1/3的量，结果如图1。

2.2 上中下部叶片蛋白质分布规律

鲜烟不同部位叶片的蛋白质电泳结果如图2，并用Image Lab软件对电泳图进行分析得到表1、表2和图3。由图2和表2可知，下部叶片有14条蛋白，分子量分布在11.8～89.4 ku，其中分子量为13.9、26.0、11.8、56.4 ku的蛋白含量较高。中部叶片有14条蛋白，分子量分布在12.0～90.5 ku，其中分子量为14.4、26.0、12.0、55.0 ku的蛋白含量较高。上部叶片约含有11条蛋白，分子量分布在11.9～72.0 ku，其中分子量为14.2、52.2、26.0、18.4 ku的蛋白含量较高。

图1 烟叶不同烘烤时间段的蛋白质含量变化趋势Fig.1 The protein content change trend of tobacco leaves at different flue-curing time

1，下部叶片；2，Marker；3，中部叶片；4，上部叶片1， Lower leaves; 2， Marker；3， Middle leaves；4， Upper leaves图2 K326不同部位烟叶的蛋白质电泳图Fig.2 The protein electropherogram of different K326 part leaves

表1标准蛋白泳道定量分析

Table1Quantitative analysis of standard protein lanes

条带编号Number分子量Molecularweight相对前沿Relativefrontier体积Volume/Int条带百分比Percentageoftheband泳道百分比Percentageoflane117000443523231213000168976504939500115602411411047200218525613513055500320584815014564300410332075737340051912321391348260062048401491449170081672561221181011010468723433

图3 Marker对应泳道剖面图Fig.3 The corresponding lane profile of marker

表2K326上、中、下部烟叶蛋白质泳道定量对比分析

Table2The quantitative comparative analysis of protein electropherogram lane from K326 upper， middle and lower tobacco leaves

泳道Lane下部叶Lowerleaves分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%中部叶Middleleaves分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%上部叶Upperleaves分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%18941590505——273830720157201935649655011552215944301942428413175382023821437702633088330733086872601392601542609882457924578245469210302131221605101951719612——11182031860718478121634316934——131393231443461424561411811512010611951

由表2可知，大分子蛋白(>40 ku)在上、中、下部叶片的含量分别为19.5%、16.3%、16%。中分子蛋白(20～40 ku)在上、中、下部叶片的含量分别为21.9%、33.1%、33.8%。小分子蛋白(<20 ku)在上、中、下部叶片含量分别为58.5%、50.5%、50.1%。烟叶中小分子量蛋白的含量最高，中分子蛋白含量较高，大分子蛋白含量最低。

2.3 不同烘烤时间烟叶蛋白质的分布规律

不同烘烤时间烟叶蛋白电泳如图4，杀青烟叶有13条蛋白，分子量分布在13.4～74.6 ku，其中分子量为13.40、26.53、49.95 ku的蛋白含量较高；烘烤3 h烟叶有15条蛋白，分子量分布在12.06～70.72 ku，其中分子量为14.15、26.53、33.15、53.26 ku的蛋白含量较高；烘烤68 h烟叶有15条蛋白，分子量分布在13.21～64.65 ku，其中分子量为13.21、29.21、32.16、49.95 ku的蛋白含量较高。

由表3和图5可看出，烟叶蛋白在不同烘烤时间段的变化情况，烟叶随着烘烤时间的增加，易被分解的大分子量的蛋白质在不断的进行降解，烘烤68 h烟叶样品中蛋白最大分子量为64.65 ku，比杀青样品中蛋白最大分子量小了近10 ku。蛋白质的种类增加，大分子量的蛋白质分解为多种中、小分子量的蛋白质。杀青样品的大、中、小分子蛋白含量为20.4%、29.93%、49.67%；烘烤3 h烟叶样品的大、中、小分子蛋白含量为15.66%、65.39%、18.95%；烘烤68 h烟叶样品的大、中、小分子蛋白含量为28.12%、42.95%、28.93%。

1，Marker；2，烘烤3 h；3，杀青叶片；4，烘烤68 h1， Marker；2， 3 h flue-curing；3， Fixing；4， 68 h flue-curing图4 不同烘烤时间K326中部烟叶蛋白质电泳图Fig.4 The protein electropherogram of K326 middle leaves at different flue-curing times

表3不同烘烤时间K326中部烟叶的蛋白质泳道分析

Table3Analysis of protein lane of K326 middle leaves at different flue-curing time

条带编号Number杀青0hFixing分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%烘烤3h3hflue⁃curing分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%烘烤68h68hflue⁃curing分子量Molecularweight/ku条带百分含量Percentageoftheband/%1746203970721996465442265231055326122949952218349951641496813840591524430025536021028349276053523320331512143216102563183402304290229211104729216182653189225637098265314352454594235147892050217224309021870421018531182021819203517811176208618271401942460121516411177503817313321313404352163911115510331414151602148803015120600313212038

图5 不同烘烤时间烟叶蛋白动态变化Fig.5 Dynamic changes in leaf protein at different flue-curing times

3 讨论

本研究发现，随着烟叶烘烤过程的进行，烟叶蛋白是一个不断降解的过程，蛋白含量逐渐降低。在不同的烘烤时间段，烟叶内的蛋白质降解的速度也不相同，K326烟叶在烘烤0～50 h蛋白质的降解速度非常快，烟叶蛋白质的含量从19%降至9%；烘烤时间从80 h到最后的140 h后，烟叶蛋白质含量的变化已经趋于平缓，即在6%左右进行变化，这与李常军等[17]的研究结果相似。

将分子量大于40 ku的蛋白归类于大分子蛋白，分子量在20～40 ku的蛋白归类于中分子蛋白，分子量小于20 ku的蛋白归类于小分子蛋白。鲜烟上部叶片中大、小分子量蛋白含量比中、下部叶片多，鲜烟下部叶片中分子量蛋白含量较高，可能因为上部叶片受到的光照更充分，新陈代谢更强，且中分子蛋白分解比大分子蛋白快，造成了上部叶片的大、小分子量蛋白较多，中分子量蛋白明显偏少的现象。鲜烟中、下部叶片的蛋白质数量、种类、不同分子量大小蛋白的含量比例都较为相似，而上部叶片与中、下部叶片存在着明显的差异[18-20]。

不同烘烤时间段烟叶中蛋白的降解规律不同。杀青样中分子量小于20 ku的小分子量蛋白含量占总蛋白条带的49.67%，但是在后续烘烤过程中小分子量却大幅度减少，这是由于鲜烟叶所积累的小分子蛋白在烘烤前期就快速分解为氨基酸，而小分子蛋白的分解和大分子蛋白的快速降解导致了烘烤3 h的样品中中分子量蛋白含量比例大幅增加。

烘烤68 h的烟叶样品中还是存在着较多的分子量在40 ku以上的蛋白质，推测这些大分子量的蛋白质应该是不易分解的膜蛋白或者结构蛋白等，相比烘烤3 h的烟叶样品，68 h样品的中分子量蛋白明显减少，而小分子量蛋白有所增加，这是在烘烤过程中中分子量蛋白持续降解为小分子量蛋白，但不是很明显，可能蛋白分解成了氨基酸参与烟叶内的美拉德反应，积累香气物质[21-23]。

本文从烟叶不同部位及不同烘烤时间段对烟叶中蛋白的分布特点进行了分析，由于烟叶的烘烤是一个复杂的蛋白质的降解代谢过程，并且不同部位烟叶蛋白的分布规律还与光照、土壤氮源与自身合成有机物的传递、叶片新陈代谢机制等因素有着密不可分的关系，但是可以确定的是，上、中、下部叶片的蛋白存在着明显差异，烟叶烘烤过程不同的烘烤阶段中不同类别的蛋白降解规律也不是一样的，现行的统一烘烤方式并不适合全部的叶片，若采用相对应各部位的烘烤工艺进行烘烤，将能进一步提升烘烤品质，提高烟叶价值。由于烟草生长过程中蛋白质的积累与后期烘烤中蛋白质分解是一个复杂的动态变化过程[24-26]，受多种因素的影响，因此如何充分调控不同部位叶片中蛋白质的有效代谢转化，从而提升烟叶质量，有待进一步研究。

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LI X， LIU F Z， YAO G M， et al.Experiments on improvement of smoking quality of tobacco with enzymatic degradation[J].TobaccoScience&Technology， 2002 (3)：14-17. (in Chinese with English abstract)

Dynamicvariationrulesofproteindegradationinflue-curedtobaccos

WANG Wanneng1， XIANG Gangliao1， ZHAI Yuchen1， MA Kuoyan2， DAI Ya2， TAN Lanlan3

(1.CollegeofPharmacyandBiotechnology，ChongqingUniversityofTechnology，Chongqing400054，China; 2.ChongqingChinaTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Chongqing400060，China; 3.SichuanChinaTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Chengdu610000，China)

To analyze and clarify the regularity of protein change in different flue-curing and different flue-curing time of tobacco leaves， and to provide theoretical basis for improving tobacco leaf quality， the dynamic changes and distribution characteristics of tobacco leaves were analyzed by SDS-PAGE and other experimental techniques. The degradation rate of tobacco protein was different at different flue-curing time， and the content of tobacco protein was decreased from 19% to 9% at 0-50 h after flue-curing， and it tended to be gentle in the later flue-curing phase. The molecular weight distribution of leaf protein was between 11.8 and 90.5 ku， and there were significant differences in the content of tobacco protein in the upper， middle and lower leaves. The content of large and small molecular weight protein in the upper leaves was higher than that in the middle and lower leaves， and the content of middle molecular weight in the lower leaves was higher than the others. The degradation rule of different types of protein in different flue-curing stages of tobacco leaf were different.

tobacco; protein; SDS-PAGE; degradation

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2120-2127

http://www.zjnyxb.cn

王万能，项钢燎，翟羽晨，等. 烤烟烟叶烘烤中蛋白质的降解动态变化规律研究[J].浙江农业学报，2017，29(12)： 2120-2127.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.22

2017-06-06

重庆中烟工业有限责任公司科技项目(2014Q116)

王万能(1971—)，男，四川开江人，博士，教授，主要从事生物代谢工程方面的研究。E-mail: wannengw@cqut.edu.cn

S572

A

1004-1524(2017)12-2120-08

(责任编辑张 韵)