MMP-9和COX-2基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

门翔，尚喜雨

（1.河南省南阳市中心医院 呼吸内科，河南 南阳 473000；2.南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000）

MMP-9和COX-2基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

门翔1，尚喜雨2

（1.河南省南阳市中心医院 呼吸内科，河南 南阳 473000；2.南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000）

目的探讨MMP-9和COX-2基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的关系。方法选取71例慢性阻塞性肺疾病患者（COPD组）和同期63例急性呼吸道感染和健康体检者（NC组）作为研究对象，PCRRFLP法测定MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）多态性，分析不同基因型与COPD的关系。结果NC组与COPD组MMP-9（R279Q）基因、COX-2（1195G＞A）的GG、AA基因型差异有统计学意义（P=0.010和0.021），G、A等位基因频率差异有统计学意义（P=0.000）。MMP基因R279Q位点的G等位基因频率基因 1195G＞A 位点的 A 等位基因频率为COPD的危险因素。MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多态性与FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相关性（P=0.015、0.018、0.009、0.009，0.021、0.017、0.015和0.000）。结论MMP-9基因R279Q位点、COX-2基因1195G＞A位点多态性为COPD的危险因素，与FEV1%pred、FEV1/FVC下降及MMP-9、COX-2升高相关。

慢性阻塞性肺疾病；基质金属蛋白酶9；环氧化酶2；基因多态性

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以持续气道阻塞为临床表现的一种慢性进展性疾病，气道和肺内对有害物质有慢性炎症反应增强的表现[1]。目前，COPD死亡率居全球第4位，世界疾病经济负担指数居全球第5位，该病严重危害人民的健康。COPD的发病机制十分复杂，环境和遗传因素日益受到重视。研究发现[2]，炎症反应贯穿COPD的发生发展过程。有报道指出，基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、环氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）与COPD的发生密切相关[3-4]，但目前对于MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）与COPD的关系研究报道较少。本研究旨在探讨上述2种基因多态性与COPD的关系，从而为临床基因靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2015年1月-2016年4月在南阳市中心医院呼吸科住院诊治的COPD患者71例（COPD组），其中，男性49例，女性22例，年龄45～76岁，平均（64.22±7.08）岁，通过体格检查、询问病史、胸部CT或X射线胸片同时结合肺功能、心电图等证实为COPD，所有患者均符合2007年版《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》的诊断标准；另选取同一时期在本院呼吸科门诊就诊的急性呼吸道感染和健康体检者63例（NC组），其中，男性40例，女性23例，年龄42～71岁，平均（62.41±6.89）岁，均未出现慢性咳嗽、咳痰、气短史等，经胸部CT或X射线胸片和肺功能（FEV1/FVC＞70%）检查排除COPD。

1.2 一般临床资料及生化指标检测

询问并记录所有受试对象年龄、性别、吸烟史、吸烟指数，记录肺功能指标：第1秒用力呼气容积占预计值百分比（percentage of forced expiratory volume in 1 second，FEV1%pred），FEV1/FVC（受试对象吸入支气管扩张剂沙丁胺醇15 min后检测）。抽取患者外周静脉血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的真空管中，离心后获得血浆，采用ELISA检测血浆中MMP-9。

1.3 外周血标本及DNA提取

采集受试对象外周静脉血5 ml，置于含有EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血样标本2 ml，采用基因组DNA快速提纯试剂盒（Promega生物试剂公司，美国）提取DNA，保存于-40℃冰箱中备用。

1.4 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性应用

1.4.1 引物合成 按照相关文献[5]设计引物，由上海英骏生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design软件设计MMP-9和COX-2基因相应位点引物，均采用小片段扩增引物。聚合酶链反应（PCR）引物：其中MMP-9（R279Q）（G）正向：5'-CATCGCTACTATTCTGGCCTTAAAGCGCATA-3'，反向：5'-GGCCTATAAGGGCCGAGCGGGTCGTAGGCC ATC-3'，PCR产物片段的长度在237 bp；COX-2（1195G＞A）（G）正向：5'-CCGGTACATGGCCTATTAAC GTGCATACGG-3'，反向：5'-CGTTGCGCAATGCTGAC CGATCA-3'，PCR产物片段的长度在124 bp。

1.4.2 目的基因扩增 PCR扩增体系为25 ml，其中含有5 ml PCR 混合物，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入双蒸水。MMP-9（R279Q）的扩增反应条件为：95℃预变性2 min，945℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 45 s，94℃变性30 s，30℃退火30 s，共计40个循环，完成后采用73℃延伸5 min，限制性内切酶为MspⅠ；COX-2（1195G＞A）的扩增反应条件为：95℃预变性2 min，93℃变性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃变性45 s，45℃退火30 s，共计40个循环，完成后采用72℃延伸5 min，限制性内切酶为RsaⅠ。取PCR产物10μl，在含有2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外线透射仪观察PCR扩增是否成功，鉴定其特异性。全部测序均由ABI3100测序分析仪（美国ABI公司）完成。为准确测定基因分型结果，随机选取10%的样本采用直接测序法进行验证。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料以%表示，采用χ2检验。群体基因型采用Hardy-Weinberg平衡检验。基因多态性与COPD的遗传效应之间的相关性采用非条件的Logistic回归分析，并经多重检验P值的Bonferroni进行校正。ROC曲线分析MMP-9、COX-2对COPD的预测价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料及生化指标检测结果

两组FEV1%pred、FEV1/FVC比较，差异有统计学意义（P=0.000），COPD组低于NC组，两组MMP-9及COX-2比较，差异有统计学意义（P=0.000），COPD组高于NC组。见表1。

2.2 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型及扩增结果

MMP-9（R279Q）位点酶切中呈现1条亮的且长度为124 bp的条带为AA型，出现58、66和124 bp 3条亮带的为GA型，出现在58和66 bp 2条带为GG型；COX-2（1195G＞A）位点酶切中呈现1条亮的且长度为237 bp的条带为AA型，出现53、220和237 bp 3条亮带的为GA型，出现在53和220 bp 2条带为GG型。随机选取MMP-9（R279Q）基因型、COX-2（1195G＞A）的PCR扩增产物行基因测序，结果显示碱基的改变与酶切结果一致。见图1。

2.3 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型分布比较

NC 组 与 COPD 组MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）位点G、A等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明符合群体代表性。NC组与COPD组MMP-9（R279Q）基因GG、AA基因型差异有统计学意义（P=0.010），G、A等位基因频率差异有统计学意义（P=0.000）；NC组与COPD组COX-2（1195G＞A）基因GG、AA基因型差异有统计学意义（P=0.021），G、A等位基因频率差异有统计学意义（P=0.000）。见表2。

表1 两组一般临床资料及生化指标检测结果

图1 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因扩增电泳图

2.4 COPD危险因素的多变量回归分析

将临床资料与生化检测指标中差异有统计学意义的因素行多变量的Logistic回归分析，以子COPD为因变量，以FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9和R279Q基因的G等位基因频率、COX-2和1195G＞A的A等位基因频率为自变量。结果显示，FEV1%predR279Q基因的G等位基因频率1195G＞A基因的A等位基因频率为COPD的危险因素。

2.5 MMP-9、COX-2对COPD的预测价值

ROC曲线分析显示，Youden指数在最大时，MMP-9、COX-2临界值分别为 53.26μg/L、75.15 ng/ml，曲线AUC显示，MMP-9、COX-2的AUC分别为0.754、0.779（P=0.017和0.012）。见图2、表3。

2.6 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）与COPD影响因素的关系

相关性分析结果显示，MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多态性与FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相关性（P=0.015、0.018，0.009、0.009，0.021、0.017、0.015 和 0.000）。见表 4。

表2 两组MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）基因型分布比较

表3 MMP-9、COX-2诊断效能分析

表4 MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）与COPD影响因素的关系 例（%）

图2 MMP-9、COX-2 的ROC曲线

3 讨论

COPD是一种临床表现为不完全可逆、呈进行性发展的气流阻塞为特征的疾病，该病主要是由长期气道阻塞导致患者肺泡缺氧以及二氧化碳潴留，引起肺血管收缩、肺血管重构，从而导致肺动脉高血压、易出现COPD患者出现右心衰竭和死亡[6]。肺血管重塑是导致COPD进一步发生恶化的关键原因，导致肺血管重塑的原因有慢性炎症、低氧或者缺氧等。低氧导致肺内高血压，从而促进肺动脉纤维母细胞和内皮细胞的促有丝分裂因子、生长因子的释放，而这些因子的释放进一步促进平滑肌细胞、成纤维细胞的增殖并进一步刺激细胞外基质的产生，导致肺动脉血管壁增厚，加重气道阻塞[7]。随着分子生物学的不断发展，环境和基因因素在COPD的发生、发展过程中存在着相互影响，关系很复杂。研究COPD的易感基因其相关因素对于防治COPD具有重要意义：①通过研究COPD的易感基因可以确定COPD发生发展的相关基因，从而寻找基因治疗的靶点；②对易感基因人群进行早期筛查和诊断，有助于早期应用药物进行干预，同时根据不同个体制定个体化COPD治疗方案。

COPD的发病机制目前尚不清楚。基质金属蛋白酶（MMPs）是蛋白酶/抗蛋白酶系统中的重要成员，与冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、高血压、2型糖尿病、肺癌、COPD以及肿瘤转移等有一定的关系[8]，MMPs成员中MMP-1、9和12均与COPD、肺气肿的发生发展密切相关，其中MMP-9是位于染色体20q11和2q13.1，具有13个外显子和9个内含子[9]。目前有研究报道[10]，MMP-9基因C-1 562T位可能存在C突变成T，而这种突变将影响到MMP-9基因的转录从而引发疾病，也有研究证实了MMP-9基因R279Q位点多态性可能为COPD易感性的危险因素。本研究在以往研究的基础上，证实了MMP-9基因R279Q位点多态性与COPD相关，值得提出的是本研究进一步探讨了MMP-9基因R279Q位点A突变成G基因与FEV1%pred、FEV1/FVC降低以及MMP-9、COX-2升高相关，说明MMP-9基因R279Q位点多态性对COPD患者肺功能、炎症反应有明显的刺激作用，导致COPD的发生发展。

COX-2是由花生四烯酸代谢过程中的重要限速酶，在前炎症因子的刺激下，机体处于验证状态后其呈高表达[11]。有文献报道指出，COX-2与多种炎性介质相互参与了COPD患者气道炎症反应过程，如IL-1、MMP-2、MMP-9等[12]，这也是本研究选择COX-2、MMP-9作为研究对象的原因，旨在探讨二者相互作用促进COPD的发生发展。COX-2基因的表达及其稳定性受到启动子区和3’端非编码区的多种转录调控因子的影响，因此其调控区域可能存在多态性改变从而影响基因表达，进而改变机体对疾病的易感性。目前有研究报道指出[13]，COX-2基因765G＞C位点基因多态性可能为COPD的易感基因位点。目前对于COX-2基因1195G/A基因位点与与膀胱癌、老年人阿司匹林抵抗有关[14]，而与COPD的关系研究报道较少。通过本研究发现，COX-2基因1195G＞A的A等位基因频率为COPD的危险因素，进一步研究证实发现，COX-2（1195G＞A）基因多态性 与 FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相关性，说明MMP-9基因R279Q位点多态性对COPD患者肺功能、炎症反应有明显的刺激作用，导致COPD的发生发展。

需要指出的是，本研究采用ROC曲线分析MMP-9、COX-2对COPD的预测价值，主要有2个方面的原因：①MMP-9、COX-2均已证实通过参与炎症反应，导致COPD的发生发展，通过绘制ROC曲线分析2者在COPD中的预测价值，为临床诊断COPD进程提供依据；②绘制ROC曲线，分析获得MMP-9、COX-2的最佳临界值，从而有利于临床COPD的发生，也便于MMP-9基因R279Q位点、COX-2基因1195G＞A位点与MMP-9、COX-2的关系研究。

综上所述，MMP-9基因R279Q位点、COX-2基因1195G＞A位点多态性为COPD的危险因素，与FEV1%pred、FEV1/FVC下 降 及MMP-9、COX-2升高相关。

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Association ofMMP9andCOX2gene polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease

Xiang Men1, Xi-yu Shang2(1. Department of Respiratory Medicine, Nanyang City Center Hospital, Nanyang, Henan 473000, China;2. Nanyang Medical College, Nanyang, Henan 473000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenMMP9andCOX2gene polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease.MethodsA total of 71 patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD group) and 63 cases of acute respiratory infection and healthy persons as the objects of study. PCR-RFLP method was used to determine the polymorphisms ofMMP9(R279Q) andCOX2(1195G＞A). The relationships between different genotypes and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) were analyzed.ResultsDifferences inMMP9gene R279Q and GG and AA genotypes ofCOX2(1195G＞A) between the NC group and the COPD group had statistical significance (P= 0.010 and 0.021), the differences in the frequency of G and A alleles had statistical significance (P= 0.000). The G allele frequency atMMP9R279Q locusand the A allele frequency ofCOX2gene 1195G＞A locuswere the risk factors for COPD.MMP9R279Q andCOX21195G＞A polymorphisms had correlations with FEV1%pred, FEV1/FVC, MMP-9 and COX-2 (P= 0.015, 0.018, 0.009, 0.009, 0.021, 0.017, 0.015 and 0.000 respectively).ConclusionsMMP9gene R279Q andCOX2gene 1195G＞A polymorphisms are the independent risk factors for COPD, and correlated with decrease of FEV1%pred and FEV1/FVC and increase of MMP-9 and COX-2.

chronic obstructive pulmonary disease; matrix metalloproteinase 9; cyclooxygenase 2; gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.010

1005-8982（2018）01-0050-06

2017-02-16

尚喜雨，E-mail：shangxiyu163@163.com；Tel：13525660096

R563.9

A

（张西倩 编辑）