新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞中的培养及纯化

张玉霞，袁小远，孟 凯，王友令

(山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250100)

新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞中的培养及纯化

张玉霞，袁小远，孟 凯，王友令

(山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250100)

利用鸡胚成纤维细胞对新城疫毒株GM0511株进行增殖培养和蚀斑法纯化，通过对最适细胞密度、病毒最佳接种浓度、覆盖琼脂糖浓度、蚀斑形成时间等条件进行优化摸索，最终获得产斑时间一致，蚀斑大小一致、出斑整齐的纯化新城疫毒株，并使原病毒血凝效价提高2个滴度，为后续实验奠定基础。

新城疫病毒； 鸡胚成纤维细胞； 蚀斑纯化

近年来，科研工作者在新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)遗传变异、进化流行趋势及疫苗开发利用等方面做了大量的工作，而获取大量纯化的NDV的流行株是开展这些工作的基础与前提。研究发现，由于疫苗的普遍使用和野毒株的广泛存在，从临床发病鸡体内分离到的NDV毒株混合现象非常普遍[1]。因此，对多种新城疫毒株进行简单有效的分离和纯化是当前必须面对的问题，用鸡胚成纤维细胞(CEF)进行蚀斑纯化是一种有效的手段被广泛使用。本试验为进一步提高毒株的纯化效果，以本实验室分离到的新城疫GM0 811株为母毒株，从CEF密度、病毒接种浓度、琼脂糖使用浓度等几个方面进行优化摸索，为获得理想的纯化ND毒株和后续实验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

9～10日龄SPF鸡胚，来自山东省家禽研究所SPF鸡场。新城疫病毒GM0 811株为本科室自行分离，经HA及HI实验鉴定为新城疫病毒。一次性6孔细胞培养板来自美国康宁公司；0.22 μm针孔滤器来自Millipore公司。DMEM高糖培养液、0.25%胰酶及小牛血清均为Hyclone产品；琼脂糖为Oxoid 100 g原装产品；0.1%中性红溶液、2×MEM溶液液等其他所需溶液均为自行配制。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚成纤维细胞制备

根据相关参考文献[2-3]，取发育良好的9～10日龄SPF鸡胚，无菌去壳取胚体，并依此剪掉头、四肢及内脏，用无菌PBS溶液漂洗3次，去除红细胞。用无菌眼科剪将洗净的胚体剪碎，倒入适量的0.25%胰酶37 ℃水浴消化约30 min，期间摇晃震荡数次，观察消化液呈白色粘稠状有拉丝现象时，可置入含5%血清的DMEM培养液中终止消化，充分吹打分散细胞团块，用200目细胞筛过滤，可得到鸡胚成纤维细胞悬液。计数后稀释成5×105个·mL-1后，接种于6孔细胞培养板内，每孔接种5 mL混匀的细胞悬液。置5% CO2培养箱37 ℃培养。

1.2.2 接毒浓度摸索

将鉴定合格的新城疫尿囊液冻融3次，用一次性0.22 μm针孔滤器过滤，用DMEM高糖培养液将病毒液10倍倍比稀释成10-1～10-10静置待用[4-5]。将长成良好细胞单层的鸡胚成纤维细胞弃去原培养液，用无菌PBS洗涤2次以去除残留的血清，将稀释好的病毒液10-1～10-10分别加入2个6孔培养板，每个稀释度1孔，每孔0.9 mL，最后一孔加等量的无血清DMEM培养液做对照。置入37 ℃ CO2培养箱吸附1 h，期间每隔15 min摇晃1次，使之均匀接触细胞。1 h后，吸弃病毒液，PBS洗去未吸附的病毒粒子。

1.2.3 琼脂糖覆盖液的准备

预先准备好A液和B液。配方如下。A液(100 mL)：pH值7.2的2×MEM溶液95 mL，小牛血清 5.0 mL，混匀过滤，置37 ℃预热。B液(100 mL)：根据参考文献共准备4个浓度，1.6 g、1.8 g、2.0 g、2.2 g琼脂糖，分别溶于100 mL的PBS液中，121.3 ℃高压灭菌15 min后，在液体状态下置56 ℃水浴待用。将预热的A液分别与B液分别取等量混合，制成4种不同浓度的琼脂糖最终覆盖液，每种浓度加入一块上述处理好的6孔培养板中，2 mL每孔，操作过程中尽量避免气泡产生。待覆盖液冷却凝固后置37 ℃的CO2培养箱，并逐日观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)。

1.2.4 蚀斑染色

待出现CPE时，向各培养板中加第2层含0.01%中性红的琼脂糖，每孔1 mL，操作同上。凝固后，将培养板倒置，放入37 ℃ CO2培养箱继续培养，4 h或过夜后观察细胞蚀斑情况。

1.2.5 细胞培养特性观察并挑斑

待培养板中出现清晰的蚀斑时，将200 μL枪头剪去头部高压灭菌，选择蚀斑数较少，斑与斑间距较大的平板进行底部标记，连同琼脂糖一起吸取并置入1 mL PBS溶液中，摇晃分散，冻融3次，3 000 r·min-1离心10 min，取上清，记为Clone1，于-20 ℃保存备用。将Clone1毒株稀释后再次按上述方法接种鸡胚成纤维细胞，蚀斑纯化3次。并分别将纯化后的病毒接种SPF鸡胚，对其收获的尿囊液进行常规HA效价检测。

2 结果

试验发现，制备的分散细胞悬液过夜后可长成形态均匀的细长型鸡胚成纤维细胞，并基本铺满培养板底部。接种病毒的时间依据细胞具体情况而定，太早细胞层太薄容易脱落，太迟则可能影响蚀斑形成。本试验在细胞培养24 h左右接种病毒，覆盖中性红琼脂糖过夜后则形成了可见的蚀斑(图1)。不同浓度的病毒液接种细胞后蚀斑形成情况差异较大，和病毒滴度成正相关，浓度越高，蚀斑越多，甚至连成片，滴度越低，蚀斑越少。琼脂糖的浓度对本实验的操作也至观重要，太稀则不宜凝固，太浓则凝固过快不能形成均匀薄层。本实验接种的新城疫毒株GM0811第一次接种后形成大小不等的蚀斑，出斑时间不一。第三次克隆后10-5病毒液接种均能出现清晰的红色蚀斑，出斑时间一致，大小整齐，各斑间距1 cm左右。纯化后病毒接种鸡胚复壮后后，血凝HA效价从原来的7log2左右提高到9log2，鸡胚死亡时间集中，血凝效价稳定。

图1 GM0 811株在CEF细胞上的增殖

3 讨论

3.1 最佳细胞浓度

鸡胚成纤维细胞生长速度较快，以长成密度稍高的单层为佳，太空了在洗涤时细胞层容易从培养板上脱落，或者因无细胞形成的空洞与病毒形成的蚀斑较易混淆。密度太高了则容易多层细胞积聚在一起，导致有蚀斑形成的地方可能会因底层细胞没有感染而无法形成可见蚀斑。

3.2 病毒最佳接种稀释倍数

最佳稀释倍数需要根据病毒毒力进行摸索调整，一般蚀斑形成能力与毒力成正相关，毒力越强的病毒蚀斑形成能力越强，如果接种稀释倍数过低，则蚀斑形成太大，容易连成片，不好进行挑斑，如果毒力较弱，而接种稀释倍数过高，则不宜形成蚀斑，无法进行病毒纯化。先摸索感染稀释度，毒价较低的时候，适当降低稀释倍数，这与文献报道[6-7]相一致。低毒力的新城疫毒株在复制时，前体糖蛋白F0敏感性较低，裂解为F1和F2的能力较弱，加入适量的胰酶可增强病毒粒子的感染性，因此，可以在覆盖琼脂中加入适量的胰酶或镁离子增强细胞的蚀斑形成能力。

3.3 琼脂糖最佳浓度

琼脂糖是从琼脂中去除了对细胞有害的物质后提炼而来，能将病毒粒子固定于某个位置形成局限性病灶。琼脂糖的浓度配比对蚀斑纯化实验操作较大影响，浓度过高则在操作过程中凝固过快，过低则凝固过慢，均影响实验操作。不同厂家生产的琼脂糖硬度也不同，本实验所用以1.8%最佳。

蚀斑技术主要用于病毒的纯化，其原理是由于病毒的遗传变异，一般的病毒株都是由许多特性不一的病毒粒子组成的混杂群体，通过蚀斑技术，选育出性状相同、产斑条件和产斑时间相同的克隆株，来保证所需毒株的免疫原性及毒力特性稳定。该技术适用于多种病毒的纯化。在具体的毒株纯化操作中，要根据毒株毒力不同，混合情况不同，所用试剂供应厂家不同等对实验条件逐步进行优化摸索。

[1] 崔治中. 免疫抑制性病毒多重感染在鸡群疫病发生和流行中的作用[J]. 畜牧兽医学报, 2003, 34(5):417-421.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学 [M]. 2版.北京：科学出版社, 1997.

[3] 章静波. 《动物细胞培养——基本技术指南》(第五版)评介[J]. 基础医学与临床, 2008(7):746-746.

[4] BARAHONA H H, HANSON R P. Plaque enhancement of Newcastle disease virus (lentogenic strains) by magnesium and diethylaminoethyl dextran[J]. Avian Diseases, 1968, 12(1):151.

[5] SCHLOER G, HANSON R P. Plaque morphology of Newcastle disease virus as influenced by cell type and environmental factors[J]. American Journal of Veterinary Research, 1968, 29(29):883-895.

[6] 王友令, 杨金兴, 袁小远,等. 新城疫GM2分离株蚀斑克隆纯化及毒力测定[J]. 浙江农业学报, 2009, 21(6):565-568.

[7] 梁荣, 曹殿军, 阎丽辉,等. 新城疫病毒分离株的蚀斑纯化及影响蚀斑形成的主要因素[J]. 中国兽医学报, 2003, 23(6):533-535.

2017-09-29

山东省农业科学院院青年科研基金(2014QNM15；2015YQN61；2016YQN56)；山东省自然科学基金(ZR2015CM009)。

张玉霞(1981—)，女，山东聊城人，助理研究员，硕士，主要从事禽病防治研究工作，Email: zyx1981_2007@163.com。

文献著录格式：张玉霞，袁小远，孟凯，等. 新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞中的培养及纯化[J].浙江农业科学，2017，58(12)：2265-2267.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171257

S858.32

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0528-9017(2017)12-2265-03

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