鸭巴氏杆菌病油佐剂灭活苗的研制

2018-01-05刘玉华陈光明

浙江农业科学 2017年12期

关键词：活苗佐剂泰州

刘玉华，陈光明

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

鸭巴氏杆菌病油佐剂灭活苗的研制

刘玉华，陈光明

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

为研究利用当地分离菌株制备鸭巴氏杆菌病疫苗的方法，本试验从泰州地区疑似巴氏杆菌病的病死鸭中分离出巴氏杆菌，经鉴定合格后作为菌种。用马丁肉汤培养后获得菌液，甲醛灭活，加油佐剂制成鸭巴氏杆菌油佐剂灭活苗。无菌检验，安全检验合格；效力检验中，免疫接种剂量为1 mL时，免疫保护率为100%，表明本次所制备疫苗安全有效。

鸭；巴氏杆菌；油佐剂；灭活苗

鸭巴氏杆菌病又名鸭霍乱、鸭出血性败血症，是一种由多杀性巴氏杆菌引起的鸭的急性败血性传染病，也是危害养鸭业的主要细菌性传染病之一[1]。该病原多杀性巴氏杆菌易产生耐药性，给抗生素治疗带来困难；另一方面，多杀性巴氏杆菌血清型众多，各地流行菌株的血清型有较大差异，而且不同血清型的菌株之间交叉保护效果差[2]。因此购买的疫苗经常对当地流行菌株的免疫效果不理想，导致各地鸭巴氏杆菌病时有发生，给养殖户带来了严重的经济损失[3]。本研究旨在探讨江苏泰州鸭巴氏杆菌分离株灭活苗的制备方法及对鸭的免疫效果，为临床预防本病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来自江苏省泰州地区某养鸭场送检的疑似巴氏杆菌病死鸭。

60日龄未接种巴氏杆菌疫苗的健康易感鸭和74日龄未接种巴氏杆菌疫苗的健康易感鸭均由泰州某养鸭场提供。

主要试剂：麦康凯琼脂粉、营养琼脂、细菌微量生化反应管等，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产；改良马丁培养基由青岛海博生物技术有限公司生产；白油由上海哈斯太润滑有限公司生产；甲醛由国药集团化学试剂有限公司生产。

主要仪器：全自动微机型立式压力蒸汽灭菌器、恒温振荡培养箱均购自河南兄弟仪器设备有限公司；数显隔水式不锈钢电热恒温培养箱购自德州市富凯化工有限公司；医用型洁净工作台购自上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 菌株分离鉴定

剖检疑似巴氏杆菌病死鸭，无菌采集肝、脾等病料，接种于鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37 ℃温箱中培养18～24 h，挑取典型单菌落进行瑞氏染色、革兰氏染色，分别镜检。对分离菌进行纯培养，将纯培养物接种于微量生化反应管，进行生化试验。

1.3 菌种毒力测定

将分离鉴定好的巴氏杆菌菌株接种于马丁肉汤(含0.1%血红素，1.0%血清)中，37 ℃培养24 h，菌液用马丁肉汤稀释成20、200、2 000、20 000 mL-14个不同浓度。15只74日龄健康鸭随机分成5组，每组3只。1～4组鸭分别肌肉接种上述4 个浓度的菌液，每只肌肉接种0.5 mL。第5组鸭为对照组，每只肌肉接种0.5 mL生理盐水，观察7～10 d，记录各组发病死亡情况。

1.4 疫苗制备

1.4.1 细菌悬液的制备

将巴氏杆菌菌种划线接种于血琼脂平板上，37 ℃孵育18 h后，挑取灰白色、圆形、湿润、露珠状菌落接种于马丁肉汤培养基中[4]，37 ℃培养18 h，按照《兽药典》的方法进行纯粹性检验[5]，合格后作为种子液。将上述种子液按培养基总量的2%接种于马丁肉汤培养基中，37 ℃振荡培养24 h，收集菌液。对菌液进行细菌计数，将菌液浓度调整为3×1010mL-1。

1.4.2 菌液灭活

按菌液体积加入终浓度为0.3%的甲醛溶液，于37 ℃温箱中灭活48 h，灭活期间振荡数次。灭活结束，取少量菌液接种于血琼脂平板，37 ℃培养24～48 h，进行灭活检验。

1.4.3 乳化配苗

每96份灭活菌液中加入4份吐温-80，充分振荡，使吐温-80完全溶解，为水相。按10号白油94 mL，硬脂酸铝2 g，Span-80 6 mL的比例混合均匀，高压灭菌，冷至室温，为油相。将油相与水相按体积比1∶1的比例混合，经组织捣碎机充分乳化即成油佐剂灭活苗[6]。

1.5 疫苗质量检验

1.5.1 物理性状检验

取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，观察疫苗分散情况，检验疫苗剂型。吸取疫苗放于试管内，3 000 r·min-1离心15 min，观察液体分层情况，检验稳定性。用1 mL吸管吸取25 ℃疫苗1 mL，让其垂直自然流出，记录流出0.4 mL所需的时间，检验黏度。

1.5.2 无菌检验

按照《兽药典》中无菌检验或纯粹检验法进行[5]。

1.5.3 安全检验

取60日龄健康鸭3只，各皮下注射疫苗1 mL，观察14 d，应全部健活。

1.5.4 效力检验

将15只60日龄健康鸭随机分成3组。第1组6只，各皮下接种1 mL疫苗；第2组6只，各皮下接种0.5 mL疫苗;第3组3只，作为对照组，不接种。14 d后，每只鸭各肌肉注射致死量强毒菌液。观察14 d，记录各鸭发病、死亡情况，剖检病死鸭，观察病理变化病况。

2 结果与分析

2.1 菌株分离鉴定

分离菌株在鲜血琼脂平板上形成灰白色、圆形、湿润、露珠状菌落，有荧光性，不溶血；在麦康凯琼脂平板上没有菌落出现。瑞氏染色镜检，可见两极着色、两端钝圆的小球杆菌，单个存在，有时成双排列。革兰氏染色镜检结果为阴性菌。生化试验结果显示，本菌可分解葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、果糖、山梨醇、半乳糖，产酸不产气；不发酵乳糖、肌醇；MR试验、V-P试验为阴性，能利用硝酸盐，产生硫化氢。分离菌株的形态染色特性、培养特性、生化特性符合多杀性巴氏杆菌的特征[7]，判定本试验所分离菌株为鸭多杀性巴氏杆菌。

2.2 菌种毒力

74日龄鸭攻毒后死亡率为100.0%时，巴氏杆菌最小攻毒菌量是每只鸭肌肉接种菌液0.5 mL，菌液浓度200 mL-1，因此确定巴氏杆菌攻毒剂量为0.5 mL，菌液浓度是200 mL-1。

2.3 疫苗制备

制备的鸭巴氏杆菌油佐剂灭活苗外观为乳白色制剂，静置后分层，上层液体微淡黄色，下层有灰白色的沉淀。

2.4 疫苗质量

2.4.1 物理性状

将疫苗滴于冷水中，疫苗不扩散，为油包水剂型。疫苗3 000 r·min-1离心15 min后没有分层，表明稳定性良好。用吸管吸取疫苗自然流出0.4 mL所需时间约5 s，符合油佐剂疫苗的黏度要求(4～6 s)[5]。

2.4.2 无菌检验

灭活苗接种于TG小管、GA斜面、GP小管中培养，观察7 d，各培养基中中均无细菌生长，表明无菌检验合格。

2.4.3 安全检验

3只健康鸭接种疫苗后观察14 d，全部健活，注射部位无肿胀、化脓等不良反应，精神、食欲未出现异常，表明研制的疫苗安全性较好。

2.4.4 效力检验

效力检验结果如表1所示。第3组鸭未接种疫苗，攻毒后发病率、死亡率均为100.0%，剖检该组病死鸭，表现巴氏杆菌的病变特征，表明对照组结果可靠。表1显示，第1组鸭接种疫苗1 mL后，攻毒后发病率、死亡率均为0，第2组鸭接种疫苗0.5 mL，攻毒后发病率、死亡率分别为33.3%和16.7%，表明本疫苗免疫剂量为1 mL时，免疫效果最好。因此确定本疫苗的免疫剂量为1 mL。