腹主动脉瘤组织中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达及意义

李维颜 张 毅 谷顺通 (天津市第五中心医院血管外科,天津 300450)

腹主动脉瘤组织中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达及意义

李维颜 张 毅 谷顺通 (天津市第五中心医院血管外科,天津 300450)

目的探讨低氧诱导因子(HIF)-1α、基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-9在腹主动脉瘤(AAA)组织中的表达及意义。方法采用免疫组化法检测68例AAA及20例正常腹主动脉组织中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达，并分析三者与临床病理参数的关系。结果HIF-1α表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞、巨噬细胞的细胞核中，MMP-2表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞的细胞质中，MMP-9表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞、巨噬细胞的细胞质中，三者在正常腹主动脉组织中均不表达。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的阳性率显著高于正常腹主动脉(P<0.001)。AAA中动脉瘤直径≥5.0 cm的患者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达高于动脉瘤直径<5.0 cm者(P<0.001)；AAA中有发生心脑血管意外史患者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达高于未发生者(P<0.001)。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9与年龄、性别、有无吸烟史及高血压无关。同时AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9表达两两呈正相关。结论HIF-1α在AAA中高表达，并与MMP-2及MMP-9起协同作用，在AAA的发生发展中起重要作用。

腹主动脉瘤；低氧诱导因子-1α；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

腹主动脉瘤(AAA)是一种腹主动脉壁的三层结构持续性扩张到正常腹主动脉直径的1.5倍以上的动脉退行性疾病，一旦AAA破裂后，得不到及时救治其死亡率达到90%以上，并且其发病率居动脉瘤首位〔1〕。目前研究认为AAA是遗传、环境、解剖学因素、免疫炎症反应、血流动力学、病原微生物及平滑肌细胞凋亡等因素共同作用的结果〔2〕。吸烟、高血压、动脉粥样硬化、血脂异常等是AAA发生的危险因素，其中动脉粥样硬化使动脉壁缺血、营养不足，进而使中层膜平滑肌细胞凋亡〔3〕。低氧诱导因子(HIF)-1α是缺血缺氧环境的中心调节因子，其信号通路与众多血管疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、主动脉瘤、肺动脉高压与慢性静脉疾病等〔4，5〕。另外，基质金属蛋白酶(MMPs)介导的动脉壁弹力纤维及胶原纤维的降解及损伤是AAA病理最直观的表现。研究显示，在AAA形成过程中MMPs活性提高〔6〕。同时有研究表明HIF-1α对MMP-2及MMP-9的表达具有调控作用〔7〕，但三种在AAA中的联合检测及意义在国内尚未见报道，本研究将对此展开讨论。

1 材料与方法

1.1一般资料 取2011年1月至2016年10月天津市第五中心医院手术，术前经影像学及临床诊断证实为AAA的患者68例标本，其中男60例，女8例，≥60岁59例，<60岁9例，年龄68～85岁，中位年龄67岁。根据手术前1 w血管造影(CTA)测定的动脉瘤体大小分：≥5.0 cm 43例，<5.0 cm 25例。同时选取20例无腹主动脉病史及血管闭塞性病史的器官移植者或尸检者的正常腹主动脉作为对照。

1.2主要试剂及仪器 兔抗人HIF-1α、MMP-2及MMP-9多克隆抗体均购自武汉博士德生物技术有限公司；二氯基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3免疫组化法检测HIF-1α、MMP-2及MMP-9表达 石蜡标本置于二甲苯、无水酒精、95%、85%、75%酒精中脱蜡。3%过氧化氢酶室温孵育20 min，于枸橼酸盐修复液中置于微波炉中修复5 min。10%山羊血清室温下封闭30 min。一抗溶液(兔抗人HIF-1α、MMP-2及MMP-9多克隆抗体，稀释度为1∶200)，4℃过夜孵育，二抗溶液室温下孵育1 h，DAB显色后冲洗。苏木素复染、1%盐酸分化，氨水反蓝。梯度酒精中脱水，二甲苯中透明，中性树脂封片，并于显微镜下观察。以磷酸盐缓冲液(PBS)液代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判断 HIF-1α蛋白主要以在细胞核中出现棕黄色或棕褐色的颗粒作为阳性表达，MMP-2及MMP-9蛋白以细胞质出现棕黄色及棕褐色的颗粒为阳性表达，由工作经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片。在高倍镜下随机选择5个视野，观察细胞的染色情况。该切片的总得分是阳性细胞百分率乘以染色评分。按细胞的染色程度评分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞所占百分率评分：未染色为0分，<25%为1分，25%～50%为2分，≥50%为3分。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0进行软件t检验、χ2检验及Fisher精确概率法检验，相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结 果

2.1HIF-1α、MMP-2、MMP-9在AAA及正常腹主动脉中的表达 HIF-1α表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞、巨噬细胞的细胞核中，阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒，在正常腹主动脉组织中不表达。MMP-2表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞的细胞质中，阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒，在正常腹主动脉组织中不表达。MMP-9表达于AAA中膜及外膜平滑肌细胞、巨噬细胞的细胞质中，阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒，在正常腹主动脉组织中不表达。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的阳性率〔61例(89.71%)，58例(85.29%)、62例(91.18%)〕显著高于正常腹主动脉(均为0；χ2=19.42、23.71、28.45;均P<0.001)。

2.2HIF-1α、MMP-2及MMP-9表达与AAA临床病理参数的关系 AAA中动脉瘤直径≥5.0 cm者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达高于动脉瘤直径<5.0 cm者(P<0.001)；AAA中有发生心脑血管意外史患者的HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达高于未发生者(P<0.001)。而AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表达与年龄、性别、有无吸烟史及高血压无关。见表1。

表1 HIF-1α、MMP-2及MMP-9表达与AAA临床病理参数的关系〔n(%)〕

2.3HIF-1α、MMP-2及MMP-9表达的相关性 AAA中HIF-1α与MMP-2，HIF-1α与MMP-9，MMP-2与MMP-9表达呈正相关(r=0.428、0.452、0.517，均P<0.01)。

3 讨 论

腹主动脉壁中膜弹力蛋白及胶原降解，淋巴细胞及巨噬细胞浸润，平滑肌细胞凋亡及血管新生是AAA组织学最为典型的变化〔2,8〕。而动脉粥样硬化是AAA发生的危险因素之一，动脉粥样硬化斑块使腹主动脉处于缺血状态，导致动脉壁局部营养缺乏及缺氧，进而导致血栓形成及平滑肌细胞凋亡，加剧AAA的程度〔3〕。HIF-1是缺氧微环境中所产生的一种调控因子，是在肝癌细胞株中发现的一种缺氧元件，主要由HIF-1α及HIF-1β两种亚基构成，前者为催化亚基，决定着HIF的活性。在正常氧条件下，HIF-1α被羟基化，并通过泛素-蛋白酶体途径降解。而在缺氧条件下呈几何倍数的表达。研究显示HIF-1α信号通路与众多血管疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、主动脉瘤、肺动脉高压和慢性静脉疾病等〔4,5〕。有研究发现在人AAA破裂边缘发现了HIF-1α的存在〔6〕。也有研究发现HIF-1α能表达于平滑肌及巨噬细胞中〔9〕。同时有研究还发现在血管紧张素Ⅱ 诱导的载脂蛋白E(ApoE)(-/-)小鼠AAA模型成形的28 d中，HIF-1α表达量持续上升〔15〕。本研究结果与研究报道一致〔9，10〕。而且本研究还说明AAA中HIF-1α的高表达提示了瘤体大小、心脑血管病史的有无，与杨世疆等〔11〕的研究通过敲除血管紧张素Ⅱ 诱导的ApoE(-/-)小鼠AAA模型中HIF-1α基因表达后，能显著减少动脉瘤大小，减弱巨噬细胞浸润及新生血管形成的研究报道一致。本研究结果提示HIF-1α抑制剂作为AAA的辅助治疗药物无须考虑患者的性别、年龄、吸烟史及高血压。

弹力蛋白及胶原是腹主动脉细胞外基质的主要成分，正常情况下，二者的合成与降解处于动态平衡当中，维持着腹主动脉的结构与功能，而在病理条件下，由于炎症细胞(巨噬细胞，淋巴细胞)分泌大量的MMPs，降解弹力蛋白，进一步激活胶原酶，分解胶原蛋白，促使AAA动脉的持续扩张甚至破裂〔8〕。MMPs是一组依赖钙、锌离子的中性蛋白水解酶，能够通过降解细胞外基质成分，参与伤口愈合、妊娠、肿瘤侵袭转移等。目前研究显示MMPs活性及表达上升是AAA典型的病理变化，炎症细胞分泌大量MMPs，降解胶原，胶原分解产物进一步的促使白细胞趋化，浸润组织，加重AAA〔6〕。其中明胶酶MMP-2能够降解胶原及弹力蛋白，另外一种分子量最大的明胶酶MMP-9能够降解Ⅳ型和Ⅴ型胶原和弹力蛋白。目前的研究证实AAA中MMP-2、MMP-9活性，蛋白及mRNA表达均显著高于正常腹主动脉组织〔6〕。本研究结果与通过抑制MMP-9表达能显著降低动脉瘤大小的研究报道一致〔6〕，也说明了MMP-2及MMP-9的表达受心脑血管病史的影响，临床治疗上需要考虑此影响。

有研究证实非小细胞肺癌中HIF-1α、MMP-2、MMP-9的表达呈正相关，三者联合检测对肺癌的诊断及治疗具有显著意义〔11〕。且低氧能够诱导人主动脉平滑肌细胞中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的高表达〔9〕。在巨噬细胞接触到镍后能显著促进HIF-1α在细胞核内聚集，进而提高MMP-2及MMP-9 mRNA表达。地塞米松能部分通过促进HIF-1α的聚集，加重血管紧张素Ⅱ诱导的AAA，同时还可以提高MMP-2及MMP-9活性〔7〕。从而提示HIF-1α能够通过调控MMP-2及MMP-9表达在AAA的发生发展中起着重要作用，作为HIF-1α的抑制剂可能成为AAA当前的辅助治疗药物。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6145-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.060

李维颜(1979-)，男，主治医师，主要从事血管外科疾病的腔内手术治疗研究。

〔2017-09-27修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)