基因沉默Smad3对四氯化碳致急性肝损伤的保护作用

王东辉 方 琳 朱 妍 陈 维 (长春医学高等专科学校基础医学部，吉林 长春 3003)

基因沉默Smad3对四氯化碳致急性肝损伤的保护作用

王东辉 方 琳 朱 妍 陈 维1(长春医学高等专科学校基础医学部，吉林 长春 130031)

目的探讨基因沉默小鼠Smad3对四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤的保护作用及可能机制。方法将36只小鼠随机平均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，向Ⅱ、Ⅳ组小鼠尾静脉注射Smad3 shRNA以抑制Smad3基因表达，Ⅰ、Ⅲ组注射空载体作为对照；向Ⅲ、Ⅳ组小鼠腹腔内注射CCl4橄榄油溶液诱导小鼠产生肝脏损伤，构建小鼠肝损伤模型，Ⅰ、Ⅱ组小鼠仅注射橄榄油作为对照；实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测小鼠肝脏组织Smad3 mRNA的表达水平；采用赖氏法检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)水平；取小鼠肝脏组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色，在显微镜下观察其病理改变。结果Ⅳ组小鼠肝组织Smad3 mRNA表达水平明显低于Ⅲ组(P<0.01)；血清ALT、AST水平明显低于Ⅲ组(P<0.01)；显微镜下观察可见Ⅳ组小鼠肝组织细胞变性、坏死数明显少于Ⅲ组，肝组织损伤程度明显较轻。结论基因沉默Smad3可减轻CCl4对小鼠的肝脏损伤作用，其机制可能为Smad3 基因沉默使小鼠体内自身产生Smad3蛋白减少，削弱了Smad3蛋白对激活素信号途径的调节作用，减轻激活素(ACT)A介导的肝损伤程度。

Smad3；基因沉默；急性肝损伤

老年患者的肝病15%～20%是由药物引起〔1〕。激活素(ACT)属于转化生长因子(TGF)-β家族成员，能促进细胞生长分化〔2〕。其中ACTA生理作用最为广泛，可通过介导细胞增殖分化、炎症反应、免疫应答等方面在疾病的发生及发展中发挥重要作用，但其发病机制仍不明确〔3，4〕。ACT可与ACT Ⅰ型受体(ActRⅠ)、ActRⅡ形成复合物并磷酸化，磷酸化后的ActRⅠ将信号传给下游的受体型Smad2、3，磷酸化的Smad2、3再与通用型Smad4形成复合物进入细胞核，进而通过调节基因的转录影响细胞内的信号传导功能〔5〕。本研究通过RNA干扰技术沉默小鼠Smad3基因，观察其对四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器 雄性C57BL/6近交系小鼠(清洁级，合格证号SCXK(京)2009-0004)36只，体重(20±2)g(北京华阜康动物实验有限公司)。CCl4(北京化工厂)；食用橄榄油购自北京可丽佩翠橄榄油开发中心；Trizol 试剂(Invitrogen公司)；SYBR qPCR检测试剂盒(TaKaRa公司)；核酸及蛋白分子量标准品(Bio-Rad公司)。CCl4溶液配制：向9.5 ml橄榄油中加入CCl4试剂0.5 ml，配制成5% CCl4溶液。7300型定时定量PCR仪(美国ABI公司)；Epoch超微量微孔板分光光度计(Biotech，美国)；CX41型生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.2动物分组和模型建立 将36只实验小鼠适应性喂养7 d，随机平均分为Ⅰ组(橄榄油+空载体组)、Ⅱ组(橄榄油+ Smad3基因沉默组)、Ⅲ组(CCl4+空载体组)、Ⅳ组(CCl4+ Smad3基因沉默组)。Ⅰ组：向小鼠尾静脉注射空载质粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄榄油试剂(10 ml/kg体重)。Ⅱ组：小鼠尾静脉注射Smad3基因沉默质粒(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄榄油(10 ml/kg体重)。Ⅲ组：向小鼠尾静脉注射空载质粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄榄油溶液(10 ml/kg体重)。Ⅳ组：向小鼠尾静脉注射Smad3基因沉默质粒(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄榄油溶液(10 ml/kg体重)。各组小鼠处理后第3天用生理盐水进行心脏灌流，处死并收集血清、肝脏组织。

1.3血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)测定 于小鼠眼部取外周血，收集于抗凝管中，室温静置30 min，3 500 r/min离心10 min得上层血清。制备好血清样品后按照试剂盒说明书进行操作，分别检测血清中ALT及AST水平，于490 nm波长处测定吸光度值并绘制标准曲线，根据曲线方程求得样品值。

1.4小鼠肝组织Smad3 mRNA水平定量检测 采用Trizol法提取小鼠肝脏组织总RNA，检测RNA含量及纯度，RNA质检合格后取1 μg进行逆转录(总体系为20 μl)，将产物稀释10倍，取2 μl进行SYBR Green I实时荧光定量PCR(RT-PCR)。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40个循环。PCR 产物的特异性通过溶解曲线检测，以 GAPDH值为内参照计算 Smad3 mRNA 的相对量。采用 2-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达水平，其中，ΔCt =(Ct目的基因-Ct内参基因)，ΔΔCt =(ΔCt 实验组-ΔCt 对照组)。

1.5小鼠肝组织病理学观察 取小鼠肝右叶新鲜组织标本，使用浓度为40 g/L的多聚甲醛固定，24 h后行常规石蜡包埋、切片(厚度3～4 μm)，进行苏木素-伊红(HE)染色。

1.6统计学分析 使用SPSS10.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1基因沉默Smad3动物模型的建立 Ⅳ组小鼠Smad3 mRNA表达水平(0.734±0.075)显著低于其余各组(Ⅰ组：1.328±0.027，Ⅱ组：1.071±0.309，Ⅲ组：2.018±0.017)。

2.2基因沉默Smad3对小鼠血清ALT、AST水平的影响 Ⅳ组小鼠血清ALT及AST水平〔(1 056.36±105.37)、(669.87±39.74)U/L〕均明显低于Ⅲ组〔(2 767.14±217.28)、(1 373.07±179.34)U/L，P<0.01〕。Ⅰ组分别为(19.65±0.36)、(28.84±0.78)U/L，Ⅱ组为(19.02±0.47)、(21.68±0.43)U/L。

2.3小鼠肝组织的病理改变 Ⅰ、Ⅱ组小鼠肝脏组织细胞呈索状排列且呈多边形，有1～2个圆形细胞核，核仁明显，核膜清楚，核内染色质稀疏，呈正常肝细胞状态。而Ⅲ、Ⅳ组肝细胞部分表现为核固缩、溶解或消失，出现变性、坏死，其中与Ⅲ组小鼠相比，Ⅳ组小鼠肝损伤明显减轻。见图1。

图1 各组小鼠肝脏病理改变(HE，×200)

3 讨 论

各种因素导致的肝损伤在肝病的发生发展中起重要作用。以往的研究表明TGF-β参与肝脏疾病的发生和发展，TGF-β是一簇具有多种功能的蛋白多肽，目前至少发现有 5 种异构体，分别为 TGF-β1～5，均对细胞的生长、分化与免疫反应有广泛的影响〔6〕。TGF-β1超家族成员ACT是一种与肝损伤有关的致炎因子。ACT有5种亚基，可分别形成ACT A、ACT B、ACT C等 9 种激素〔2〕，ACT A在刀豆蛋白(Con)A诱导的免疫性肝损伤过程中发挥重要的致病作用〔7〕。

ACT信号传导分为细胞外传导、受体传导和受体后传导，Smads是ACT受体下游的信号分子，通过Smads蛋白调控属于受体后调节〔5〕，Smad蛋白有8种型，受体调节型 Smad(R-Smads)包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和 Smad8，通用型Smad(Co-Smads)只有Smad4，抑制型Smad(I-Smads)有Smad6和Smad7〔8〕。ACT依次与ActRⅡ、ActRⅠ结合，并使其磷酸化，进而激活下游的Smad2/3，从而进行细胞内信号的传导〔9〕。有研究者采用 RNA 干扰技术，将针对 Smad3的siRNA 转染入肝星状细胞(HSCs)，结果抑制了 HSCs 的增殖，而且还可上调P53、下调Bcl-2表达，从而促进 HSCs 凋亡，最终达到抑制肝纤维化发展的目的〔10〕。CCl4诱导肝损伤模型是目前急性肝损伤的经典模型，损伤作用主要是由于炎症因子的过量释放和炎性细胞的大量聚集而产生。另外，作为调控炎症反应的重要因子，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ也在急性肝损伤的发生发展过程中起重要作用〔11〕。

本研究结果提示ACT信号传导途径ACT A-ActRⅡA-Smad途径的阻断削弱了CCl4诱导的小鼠肝损伤，基因沉默Smad3对CCl4诱导的肝损伤有一定的保护作用。

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R575

A

1005-9202(2017)24-6023-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.008

吉林省科技发展项目(20060928-01)

1 吉林大学中日联谊医院神经内科

陈 维(1964-)，男，主任医师，主要从事脑血管疾病临床研究。

王东辉(1968-)，女，博士，教授，主要从事基因治疗及细胞信号传导研究。

〔2017-03-20修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)