保留软骨的去细胞全喉支架制备方法及在喉软骨缺损中的修复效果

苏莉莎 彭 涛 冯 俊 李红光 李志勇 杜经纬 马 鹏 吉 爽

(川北医学院第二临床医学院 南充市中心医院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000)

保留软骨的去细胞全喉支架制备方法及在喉软骨缺损中的修复效果

苏莉莎 彭 涛 冯 俊 李红光 李志勇 杜经纬 马 鹏 吉 爽

(川北医学院第二临床医学院 南充市中心医院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000)

目的探讨保留软骨的去细胞全喉支架的制备方法及在大鼠喉软骨缺损中的修复效果。方法取6只大鼠用于支架的制备，分离颈总动脉，结扎分支，经颈总动脉灌注去污剂(SDS、Triton X-100、PBS离子型)，3只大鼠去除喉黏膜、肌肉、韧带的同时，保留细胞外基质和软骨细胞制备保留软骨的去细胞全喉支架，其余3只用于制备对照组支架。另取34只大鼠，建立0.5 cm×0.5 cm全层喉软骨缺损模型，根据处理方法不同随机分为对照组(n=17)和保留软骨组(n=17)，对照组植入未经处理的异体喉骨支架，保留软骨组植入保留软骨的去细胞全喉支架，比较两组的修复效果。结果①两种支架经过脱细胞灌注处理后，全喉大体结构完整，体积未发生明显的变化；②保留软骨的去细胞全喉支架未见表面细胞组织填充，可见胶原、细胞外基质成分组成的腔隙，细胞之间结构紧密，存在于会厌、声带、环状软骨等表面；对照组支架组织中的细胞成分被完全去除，但是依稀可见网状连接，结构之间不紧密；③免疫荧光结果显示：保留软骨的去细胞全喉支架除了有肌肉、软骨细胞外，主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阴性；对照组支架免疫荧光染色下MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阳性；④保留软骨组大鼠修复6 w后缺损部位存在少许不成熟的软骨细胞，极少的软骨形成陷窝，表面存在纤维组织及炎症细胞；修复12 w后缺损部位得到修复，形成软骨陷窝，炎症反应减少；对照组修复6 w后缺损部位周围软骨细胞较少，缺损部位与周围组织边界明显，存在大量炎症细胞；修复12 w后存在少量纤维组织，存在炎症因子。结论保留软骨组植入保留软骨的去细胞全喉支架在喉软骨缺损中具有良好的修复效果。

去细胞全喉支架；喉软骨缺损；免疫排斥反应；全层喉软骨缺损模型

喉是人体中相对比较重要的器官，由软骨、肌肉、黏膜、腺体等组成，先天性畸形、疾病或创伤等均容易引起喉软骨缺损，发病后不仅会影响发音、吞咽及呼吸功能，还会影响患者美观。由于喉所处位置特殊，当喉缺损后再生能力相对较低，患者在移植术后需要长期服用免疫抑制剂，增加了感染率肿瘤患者增加复发及转移率，难以达到预期的治疗效果〔1〕。有报道〔2〕显示，通过去细胞方法能构建出具备天然三维结构的支架，且支架中复合种子细胞能制备出具备移动功能的组织或器官。由于喉的支架具备合成和分泌软骨基质、胶原纤维的能力，再加上软骨细胞被软骨基质严密包裹，能避免软骨细胞与外界的抗原物质相互接触〔3〕。报道显示〔4〕，保留软骨的去细胞全喉支架能维持原有软骨细胞的活性，将其运用于喉软骨缺损中效果理想，能促进缺损部位早期愈合，提高修复效果，但是该结论尚未得到进一步证实。此外，直接的同种异体移植需要长期使用免疫抑制剂，避免免疫排斥反应。通过对人喉主要组织相容性抗原研究发现〔5〕：人喉主要组织相容性抗原位于黏膜上皮层、黏膜下腺、软骨膜，而在软骨基质中并不表达。因此，保留软骨植入同种异体中并不会引起免疫排斥反应。本课题旨在探讨保留软骨的去细胞全喉支架的制备方法及在大鼠喉软骨缺损中的修复效果。

1 对象与方法

1.1对象 取2014年10月至2016年4月进行实验的SD大鼠40只作为研究对象，雌雄随机，4月龄，体重190～230 g，平均(214±12)g，所选动物均由医院动物实验中心提供。实验过程中对SD大鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导下意见》〔6〕相关规则，许可证号SCKK2015-0023，均给予精制颗粒饲料，自由饮水。实验均通过医院动物委员会批准同意。40只大鼠，6只大鼠用于支架的制备，34只大鼠建立全层喉软骨缺损模型，根据处理方法不同随机分为对照组和保留软骨组，每组17只。

1.2主要仪器和试剂 见表1。所用的仪器和试剂均由相应公司提供。

表1 主要仪器和试剂

1.3方法 去细胞全喉支架制备：取6只大鼠用于支架的制备，将大鼠放置在CW-CJ-ZFD超净工作台上，1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠仰卧、固定在手术台上，脱毛剂备皮，待麻醉生效后消毒、铺巾〔7〕。从大鼠颈前正中部位做长3 cm切口，逐层分离皮下组织、颈前肌群，充分暴露气管、喉、两侧颈总动脉，分离颈总动脉上的甲状腺下动脉，结扎分支。在双侧甲状腺下动脉分叉下端1.5 cm部位放置0.45 mm的头皮针，利用丝线固定头皮针。通过头皮针向血管中注入少许肝素、生理盐水，检测血管的完整性，切断颈总动脉结扎部位的血管，游离喉、颈外动脉，去除喉黏膜、肌肉、韧带的同时保留细胞外基质和软骨细胞制备保留软骨，其余3只用于制备对照组支架(对照组支架不经过任何处理)；保留软骨的去细胞全喉支架经颈总动脉利用把控麻醉泵向甲状腺动脉、甲状腺下动脉采用含有腺苷、肝素钠的PBS进行15 min灌注，采用1%十二烷基硫酸钠(SDS)的去离子水持续24 h灌注，采用去污剂(SDS、Triton X-100、PBS离子型)，灌注速度为20 ml/h，连续灌注15 min，在灌注的同时，在喉组织上方放置一输液瓶，滴加RPMI1640培养液，为喉支架提供营养，避免喉体干燥，制备保留软骨的去细胞全喉支架〔8〕。

全层喉软骨缺损模型建立及处理方法：另取34只大鼠，耳缘静脉注射4%异戊巴比妥(60 mg/kg)进行全身麻醉，将大鼠固定在手术台上，对颈部进行剃毛、常规消毒后铺巾，从颈前正中作5 cm切口，分离皮下、基层，充分暴露甲状软骨，并且在左侧利用0.5 mm×0.5 mm钻头(钻头3 cm部位刻有标记)作0.5 mm×0.5 mm全层软骨缺损，建立大鼠全层喉软骨缺损模型，深度以钻头标记部位为准，避免穿透喉黏膜，见图1〔9〕。

大鼠喉软骨缺损模型建立完毕后进行止血处理，采用生理盐水对建模部位进行清洗。取制备好的保留软骨的去细胞全喉支架与对照组支架，将其修剪为0.5 mm×0.5 mm大小，对照组采用未经处理的支架进行修复，保留软骨组植入保留软骨的去细胞全喉支架修复，连续进行12 w修复。两组大鼠修复后对创面进行缝合，采用由纱、无菌纱布组成的双层敷料对创面进行覆盖、包扎，并根据每一位大兔情况做好预防性感染措施，送回笼中饲养〔10〕。标本的收集及保存：两组大鼠修复6、12 w时采用脊椎脱臼法每组分别处死7只和10只SD大鼠，取缺损部位修复组织，并将双侧关节放入浓度为4%的多聚甲醛溶液中保存、待用〔11〕。

图1 全层喉软骨缺损模型建立

1.4观察指标 (1)支架大体观察。观察保留软骨的去细胞全喉支架与对照组支架大体情况。(2)支架扫描电镜观察。取两组制备的支架，简单修剪后，采用离子溅射仪进行喷金镀膜，扫描电镜观察两种材料的形态、结构〔12〕。(3)免疫学检测。将两组支架放入4%多聚甲醛中固定，利用蔗糖梯度脱水后，冰冻切片机进行切片，PBS 3 min清洗，连续冲洗3次，将切片放入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，煮沸，自然冷却30 min，PBS冲洗3次，加入大鼠主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ RT1a、抗大鼠MHCⅡ H-2L一抗，加入等量PBS溶液作为阴性对照组，加入二抗，PBS冲洗后进行二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)3 min染色，荧光显微镜下观察〔13〕。(4)HE染色。两组大鼠修复6、12 w后取大鼠喉部及周围组织，将其放入甲醛中固定，无水乙醇梯度脱水，制备4 μm切片，行HE染色，光镜下观察缺损部位形态〔14〕。

1.5统计学方法 应用SPSS18.0软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。

2 结 果

2.1实验动物数量分析 参加实验的40只SD大鼠全部进行结果分析，中途无脱落。

2.2支架大体观察比较 两种支架经过脱细胞灌注处理后，全喉大体结构完整，喉组织颜色为苍白色、透明，体积未发生明显的变化，硬度无明显的改变，喉的三维结构无明显变化。见图2。

2.3两组支架扫描电镜观察 保留软骨的去细胞全喉支架未见表面细胞组织填充，可见胶原、细胞外基质成分组成的腔隙，细胞之间结构紧密，存在于会厌、声带、环状软骨等表面；对照组支架组织中的细胞成分被完全去除，但是依稀可见网状连接，结构之间不紧密。见图3。

2.4两组支架免疫学水平比较 免疫荧光结果显示：保留软骨的去细胞全喉支架除了有肌肉、软骨细胞外，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阴性；对照组支架免疫荧光染色下MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阳性。见图4。

图2 支架大体观察比较

图3 两组支架扫描电镜观察(×100)

A：保留软骨组；B：对照组；C：软骨组织，P：骨膜，DM：细胞基质，M：肌肉，下图同图4 两组支架免疫学水平比较(×100)

2.5两组大鼠修复后大体观察 两组大鼠修复后均呼吸通畅、正常，未出血喘鸣等，进食和活动情况良好，术后伤口均一期愈合，未见化脓或感染现象。保留软骨组大鼠均未见排斥反应，对照组大鼠修复后需要服用免疫抑制剂。

2.6两组大鼠修复后6 w、12 w HE染色情况比较 保留软骨组大鼠修复6 w后缺损部位存在少许不成熟的软骨细胞，极少的软骨形成陷窝，表面存在纤维组织及炎症细胞；修复12 w后缺损部位得到修复，形成软骨陷窝，炎症反应减少；对照组修复6 w后缺损部位周围软骨细胞较少，缺损部位与周围组织边界明显，存在大量炎症细胞；修复12 w后存在少量纤维组织，存在炎症因子，见图5。

A、C图分别为保留软骨组大鼠修复6 w、12 w HE染色情况；B、D图分别为对照组大鼠修复6 w、12 w HE染色情况图5 两组大鼠修复6 w、12 w HE染色情况比较(×100)

3 讨 论

软骨缺损是临床上常见的疾病，该部位位置相对特殊，缺乏血管及再生能力，当软骨部位发生缺损后自我修复能力相对较差，难以满足修复要求。随着医疗技术的不断发展，软骨组织缺损修复经历了传统自体修复到异体骨修复及人工材料修复过程，为软骨缺损的修复提供方法〔15〕。软骨组织工程技术是一门新型的学科，通过制备干细胞并接种在支架上植入缺损部位后能形成新的组织，实现软骨部位的修复〔16〕。

由于喉部位缺乏丰富的血运、神经，自体移植受到来源及大小的限制难以满足修复需要，异体骨移植后由于含有免疫细胞及免疫组织，导致喉移植后难以解决免疫排斥问题。目前，喉支架复合物MHC常表达于供体的淋巴细胞及树突细胞中，属于最常见的致敏原，且免疫排斥反应与供体、受体中MHC抗原的匹配程度关系密切。本课题利用灌注去离子剂法制备去细胞全喉支架，制备过程中去除了介导免疫排斥反应的主要组织〔17〕。两种支架全喉大体结构完整，苍白色、透明，体积未发生明显的变化，硬度无明显的改变，提示利用脱细胞灌注处理后能制备理想的支架。保留软骨组织是一种特殊的组织〔18〕，能合成和维持软骨基质的结构，能维持三维支架结构。此外，软骨部位在支架中被软骨基质包裹，不会与外界接触，能降低免疫排斥反应。本研究中，免疫荧光结果显示，保留软骨的去细胞全喉支架具有良好的生物相容性，植入机体后不会引起免疫排斥反应，被称为“免疫豁免性”，即在同种异体移植中不会产生免疫排斥反应〔19〕。去细胞全喉支架经过去细胞处理后，主要成分为细胞外基质、软骨细胞，而细胞外基质主要是由蛋白和活性分子构成，能构成一种动态平衡〔20〕。为了进一步验证去细胞全喉支架的修复效果，本课题中建立了大鼠喉软骨缺损模型，分别植入喉软骨缺损去细胞全喉支架与未经处理的支架，结果表明两组大鼠修复后均呼吸通畅，进食和活动情况良好，术后伤口均一期愈合，未见化脓或感染现象。保留软骨组大鼠均未见排斥反应，对照组大鼠修复后需要服用免疫抑制剂，可见两种支架均能促进喉软骨部位修复，但是对照组需要长期服用免疫抑制剂抑制排斥反应，不利于缺损部位修复〔21〕。组织学分析提示去细胞全喉支架能促进缺损部位修复，有效抑制炎症反应，提高缺损部位修复。而未经处理的支架植入异体缺损部位后容易发生免疫排斥反应，增加机体炎症发生，不利于组织、器官的再生〔22〕。

综上所述，利用环甲动脉持续灌注去污剂在去除喉黏膜、肌肉、韧带的同时，保留细胞外基质和软骨细胞能成功制备SD大鼠去细胞全喉支架，运用于大鼠喉软骨缺损中能促进缺损部位愈合，具有广泛的运用前景。

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R76

A

1005-9202(2017)24-6013-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.004

四川省卫生厅资助项目(No.140112)

苏莉莎(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事耳鼻咽喉科临床研究。

〔2017-04-10修回〕

(编辑 袁左鸣)