DWARF14响应独角金内酯信号的分子机制

刘虎 姬朝光 刘坤

摘要：独脚金内酯是一类由类胡萝卜素衍生而来的新型植物生长调节因子，能够从抑制根部分生、诱导侧根形成、促进根毛伸长、介导根部与共生真菌和寄生植物信号通讯等多个方面调控植物生长发育。独角金内酯受体DWARF14（D14）起源于α/β水解酶，其信号转导机制不同于传统植物生长调節因子受体，它遵循新型的“底物-酶-活性分子-受体”识别规律，具有生成和感知生长调节因子活性分子的双重功能。综述了独脚金内酯受体D14结构及信号转导机制最新研究进展。

关键词：独脚金内酯；生长发育；DWARF14；CLIM；分子识别机制

中图分类号：Q94 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）20-0009-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.002 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Strigolactones（SL） is a new plant growth regulators derived from the carotenoid， which regulates the growth and development of plants， including inhibition of root branching， formation of lateral root， elongation lateral root and rhizospheric communication with symbiotic fungi and parasitic weeds. DWARF14 is the receptor of strigolactones that is originate from α/β hydrolase， whose signal transduction mechanism is different from classical growth regulators， and has the dual function of producing and sensing growth regulators active molecule. In this article， the newest research of the structure and molecular recognition mechanisms of D14 were summarized.

Key words： strigolactone；growth and development；DWARF14；CLIM；molecular recognition mechanisms

植物生长调节因子是一类能够调控植物生长发育的有机内源物质，其不仅能从植物各个生长阶段调控生长发育，而且也是免疫应答中的重要因子[1]。随着现代生物学研究技术的进步，人们对多种植物生长调节因子及其受体结构研究取得了重要进展，其中，新型植物生长调节因子独脚金内酯（Strigolactones，SL）能够调控植物分枝[2]、介导寄生杂草种子萌发及共生真菌生长，尤其在磷酸盐匮乏的环境下，高等植物会增加独脚金内酯产量，抑制根部分生，将资源从非必需叶片、分枝转移到主干和根系，从而使植物更易于在资源匮乏的条件下生存，这对于农业生产具有重要指导意义[3]。目前已证实独脚金内酯受体为DWARF14（D14），与传统植物生长调节因子受体通过非共价键可逆结合活性分子、循环触发信号传导链进行信号传导不同，其遵循新型的“底物-酶-活性分子-受体”识别规律，具有生成和感知活性分子双重功能。本文综述了独脚金内酯受体D14结构及信号转导机制最新研究进展，并对其进行了展望。

1 D14具有α/β水解酶功能

独脚金内酯受体D14与赤霉素可溶性受体GID1都由α/β水解酶超家族衍生而来[4]，两者在结构和功能上极其相似。在α/β水解酶衍生成为D14的过程中，α/β水解酶的第一段α螺旋（αA）被两段310螺旋（η2-η3）代替，α/β水解酶的第一段β折叠（β1）缺少。其中，位于二级结构中间区域的αT1-αT4形成帽子结构，恰好将位于核心区域的底物结合口袋封闭[5]（图1A）。同样起源于α/β水解酶的赤霉素受体GID1与D14不同，其帽子结构位于氨基酸序列非常特异且高度保守的N端延伸区（包含1～62位氨基酸），该延伸区的三段α螺旋（αa-αc）形成平板盖将赤霉素结合口袋覆盖。其中，该延伸区也是GID1相对于α/β水解酶增加的区域[6]。D14与GID1最大的不同之处在于，D14保留了α/β水解酶中的催化三联体Ser-His-Asp，而GID1中的His被Val代替，因此GID1不具有水解酶活性[7]，而D14保留了水解酶活性。

目前已从拟南芥、水稻及牵牛花等多种植物中鉴定并解析出独脚金内酯受体D14晶体结构，通过结构比对发现，不同种属的D14晶体结构几乎可以完全叠合[5]。在AtD14-GR24晶体结构中，αB-αE分布于由7段β折叠形成的中心β片层一侧，其余α螺旋位于中心β片层另一侧，D14顶端的αT1-αT4空间排布成双层V形帽子结构，由β4、β7及β6形成的催化三联体Ser97-His247-Asp218位于独脚金内酯结合口袋底部[8]，结合口袋在空间上足够大，以确保具有庞大芳香环侧链的独脚金内酯能嵌入结合口袋（图1B、图1C）。

独脚金内酯属于萜类小分子化合物[9]，其分子结构包括三环内酯（Tricyclic lactone，ABC-OH）、烯醇醚键（Enol ether bridge）及羟甲基丁烯内酯（Hydroxymethyl butenolide，D-OH），ABC-OH和D-OH通过烯醇醚键连接在一起[10]，不同独脚金内酯的差异性在于ABC-OH的取代基。D14水解底物的过程分多步进行，产生多种中间产物，不同产物能够激发不同的信号通路（图1D）。超高效液相色谱（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）和电喷雾质谱（Electrospray mass spectrometry，ES-MS）结果表明，GR24的最终水解产物为ABC-OH和D-OH[6]。

在独角金内酯进入结合口袋时，其A-ring部分进入结合口袋，B-ring、C-ring及D-ring完全进入结合口袋并通过氢键作用及疏水作用进一步被固定在口袋内部，此时的底物处于待水解状态。在第一步水解过程中，D-ring能够被Ser97识别并发生亲核取代反应，电子从Ser97羟基基团转移到由His247和Asp218形成的电荷传递网络[6]，底物被水解成ABC-OH和中间产物1（产物1实质上是开环状态下的D-OH）。第二步水解中，ABC-OH从疏水口袋释放出来，与Ser97羟基基团相连的中间产物1通过氢键网络（由水分子介导，H247、Y159参与形成）继续被固定在疏水口袋内部，经由水分子介导，C1发生分子内部加成反应形成中间水解产物TMB（2，4，4，-trihydroxy-3-methyl-3-butenal，TMB）。在第三步水解过程中，TMB的C1羟基基团转移到C4羰基上，形成最终产物D-OH。结构比对及电子密度结果发现，D14结合底物GR24前后，其构象仅发生了轻微改变，主要包括两个方面，第一，AtD14表面柔性区的带电氨基酸残基构象发生了轻微变化，可能与AtD14水解独脚金内酯过程中发生的电子转移反应有关；第二，AtD14与底物的结合使得S97（具有水解活性）和C191（涉及到与水解活性相关的保守区域折叠）的刚性加强[11]。随后通过相同方法比对了AtD14-GR24、AtD14-TMB及AtD14-D-OH构象，结果显示三者表现出几乎完全相同的表面构象。

为了进一步探究配体结合底物机制，科研工作者设计了F28W、S97C、F136V、W155F、C191V、R217H、S220I、H247A等底物结合口袋相关的突变体，通过氢氘交换（Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry，HDX）技术探究了AtD14与GR24（独角金内酯的类似物）的结合情况。结果表明，R217H几乎不影响AtD14对GR24及其水解中间物的结合，而S97C、S220I、H247A使得D14完全丧失GR24结合活性。这表明，上述除R217以外的其余氨基酸对D14与GR24的结合具有重要作用。早期研究发现，催化三联体中的His297突变为Gla后使得D14酶活性缺失，而D14（His297Gla）丧失了与SLR1（赤霉素信号抑制因子，属DELLA家族）的互作能力，表明D14的酶活性是D14与SLR1互作的前提[12]。同样，在GR24诱导的D14与D3（一种F-box蛋白，与独脚金内酯信号通路密切相关）互作过程中，D14的酶活性也是D14与D3互作的重要前提[11]。

2 D14介导的信号通路

在低浓度独脚金內酯情况下，独角金内酯信号抑制剂D53/SMXLs[13]结合转录因子TCP（Teosinte branched1/Cycloidea/Proliferating cell factor1，TCP）[14]使得独角金内酯信号通路受到抑制。当独脚金内酯浓度足以激发独角金内酯信号通路时，D14识别结合独脚金内酯将其水解为活性分子CLIM（Covalently linked intermediate molecule，CLIM），同位素标记试验证明CLIM是由独角金内酯的D环衍生而来的C5H5O2化合物。水解后的CLIM继续被封闭在底物结合口袋内，随后D14CLIM招募SCF（ASK1-CULLIN-F-BOX）复合体并与D3（属F-box蛋白家族）蛋白结合进一步形成SCFD14复合体。SCFAtD14通过其D3蛋白特异性识别结合SL信号抑制因子D53/SMXLs，经由泛素结合酶E2介导将D53/SMXLs多泛素化修饰，最终通过26S蛋白酶体将多泛素化的D53/SMXLs降解，从而解除D53/SMXLs对SL信号通路的抑制[14]，促进下游基因表达（图2）。其中，SCF的活性受到泛素相关蛋白（Related to ubiquitin 1，RUB1）的调控，RUB1是一种类似于泛素的蛋白，它可以共价连接到CUL1上，而RUB1对CUL1的修饰作用又受到多种酶的调节[15]。

有关研究表明，D14将独角金内酯水解为最终产物D-OH后，D-OH充当“塞子”将底物结合口袋封闭后，在D14的αA与αB之间的疏水表面形成亲水补丁，进而促进D14与SLR1的相互作用[12]，但对于D14与SLR1形成异源二聚体以后的信号通路还不甚了解。除SLR1外，DELLA家族其他成员可以与赤霉素转录因子PIFs[16]、茉莉酸信号抑制剂JAZs[17]、油菜素内酯转录因子BZR1[18]发生相互作用，其中，JAZs能够抑制DELLA与PIFs之间的相互作用[19]，OsD14可以与赤霉素信号抑制剂SLR1相互作用[12]，而赤霉素诱导的OsGID1-SLR1的互作又能抑制OsD14-SLR1之间的互作[12]，表明DLELLA蛋白在多种信号通路中具有重要作用。此外，独脚金内酯还与生长素共同调控不同温度条件下根的伸长[20]，与脱落酸共同调控干旱条件下的免疫应答[21]。

3 D14传导独角金内酯信号的结构机制

2016年AtD14-D3-ASK1三维晶体结构被解析[22]，其结构与TIR1-ASK1复合体、COI1-ASK1复合体类似[23]。AtD14-D3-ASK1复合物整体呈现出海马形状，AtD14为海马头部，D3 LRR（Leucine-rich repeat domain of D3，D3 LRR）序列组成海马的身体，D3 F-box（F-box motif of D3，D3 F-box）和ASK1（Arabidopsis SKP1-like1，ASK1）构成海马尾部，位于D3氮端的F-box蛋白与ASK1连接，位于D3羧基端的LRR与D14连接。LRR首尾相连的原则在空间内螺旋折叠，空间排布成马蹄铁形状，其在空间位置上正对AtD14疏水空腔（S97、H247、D218）。其中，LRR13保守性很低，可能参与蛋白之间的相互作用，LRR15、LRR16、LRR17及LRR19的α螺旋与β折叠之间都存在一段较长柔性区域，这些柔性区域涉及到D3与D14的相互作用。

D14水解GR24引发的构象变化是D14识别结合D3的前提，但D14不是直接将GR24水解成最终产物D-OH诱发两者之间的相互作用，CLIM才是诱发D14与D3相互作用的关键物质，已经通过排阻色谱及串联质谱等方法证实了这一点[22]。在AtD14-D3-ASK1复合体中，CLIM通过与AtD14的Ser297、His24形成共价键以及由Phe28、Phe126、Phe175、Leu179及Val194等氨基酸形成的氢键网络被封闭在结合口袋内。值得注意的是，β7-αE之间柔性区域（包含Asp218）的空间位置发生了偏移，使得Ser297-His24-Asp218催化三联体遭到破坏，阻止了CLIM的继续水解。另外，β7-αE之间的柔性区域可能参与D14与抑制因子D53/SMXLs的相互作用[11]。

根据接触面积大小，将D14与D3的互作界面分为两部分，一部分由D14底物结合口袋平板盖组成，另一部分由接近平板盖的较短螺旋和柔性区域组成。前者包含由4个氨基酸组成的广泛分子间氢键网络，氨基酸分别为位于loop16区域的Thr599D3、Asp606D3以及位于αT3螺旋区域的Glu174AtD14、Arg177AtD14，该氢键网络能够被Thr602D3与Glu245AtD14之间的氢键以及Ser608D3与Val164AtD14之间的范德华力进一步稳定。后者可进一步划分为亲水和疏水两个不同的区域，疏水区域的蛋白互作主要依靠范德华力，涉及该过程的氨基酸包括位于LRR区域的Leu609D3、Arg612D3、Leu644D3、Pro645D3、Leu649D3、Phe669D3以及位于平板盖区域的Ala160AtD14、Val164AtD14、Phe180AtD14；亲水区域的蛋白互作主要依靠AtD14部分表面区域以及D3 LRR18和LRR19形成的氢键网络，AtD14部分表面区域在底物结合口袋处于开放状态时被αT3遮蔽，关闭状态时暴露出来。参与形成氢键网络的氨基酸包括Asn11AtD14、Asp31AtD14、Ser33AtD14、Asp52AtD14、Cys55AtD14、Gly57AtD14、Val59AtD14、Asn181AtD14、His666D3、Glu667D3、His668D3、Thr699D3、Arg702D3。研究表明，F180AtD14、P161AtD14、E174AtD14、R177AtD14、D606D3、L644D3、R702D3等氨基酸的突变显著减弱了GR24诱导的AtD14-D3之间的相互作用[11，22]。

在D14与D3相互作用的过程中，D14构象发生了巨大的变化，底物结合口袋由开放状态转变为关闭状态。如图3所示，在D14结合口袋由开放状态转变为关闭状态时，αT2由螺旋状态转变为无规则卷曲状态，αT2与αT1之间的柔性区（Loop between αT1 and αT2）由无规则卷曲状态转变为螺旋状态，这种二级结构的转变使得αT2能够在空间位置上转向αT1，αT3转向αT4，结合口袋逐渐缩小直至完全封闭。这种转变使得αT1-αT4最终转变成为D14-D3互作界面，进一步促进D14与D3的相互作用。氢氘交换质谱（HDX）研究发现，D3与D14的结合增加了D14的氘交换速率，增强了D14活性，使D14处于更加“興奋”的状态，这种兴奋状态可能更易于D14与D3的进一步相互作用。D14-D3形成异源二聚体后被SCF识别，激活下游信号通路，调控基因表达，发挥独角金内酯的调节作用。

4 展望

在植物生长发育过程中，植物生长调节因子与生长发育信号途径或免疫信号途径共同形成一个既协同又拮抗的复杂调控网络，多方面调控植物的生长发育与免疫应答反应。植物生长调节因子受体是植物生长调节因子信号转导途径中极其重要的参与者，对受体结构的研究有助于加深人们对生长调节因子信号识别机制的认识，为进一步研究植物生长调节因子信号转导机制提供理论依据。在独脚金内酯介导的信号通路中，D14对独脚金内酯及其同源物的水解过程分多步进行，不同的水解产物诱导不同的信号通路，独脚金内酯能够间接参与赤霉素、茉莉酸、油菜素内酯等多种生长调节因子介导的植物生长发育调控，这些发现为认识独脚金内酯信号通路以及独脚金内酯与其他植物生长调节因子相耦连的信号通路提供了新的见解，但这个认识远远不够，对于其精确分子识别机制以及信号通路还有待于研究。除此之外，AtD14-D3-ASK1、TIR1-ASK1、COI1-ASK1复合体结构的类似以及相似的信号识别机制为研究植物生长调节因子结构提供依据。还有研究表明，水杨酸受体NPR1可以与CUL3互作结合，说明NPR1遵循的信号通路可能与独角金内酯、赤霉素、茉莉酸遵循的信号通路类似。探究独脚金内酯的奥秘，为基于其结构设计新型人工植物生长调节因子提供可能，从而开启利用外源物调控植物生长发育的新时代。

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