黑水虻幼虫血细胞类型的研究

毛 敏,蒋春先*,柳明刚,李 庆,杨群芳,王海建

(1.四川农业大学农学院，成都 611130；2.自贡市植物检疫站，四川自贡643000)

黑水虻幼虫血细胞类型的研究

毛 敏1,蒋春先1*,柳明刚2,李 庆1,杨群芳1,王海建1

(1.四川农业大学农学院，成都 611130；2.自贡市植物检疫站，四川自贡643000)

黑水虻Hermetiaillucens(L.)是一种重要的资源昆虫。本文旨在筛选出适合黑水虻血细胞观察的染色方法，明确黑水虻血细胞类型、数量及组成，为黑水虻血细胞免疫研究奠定基础。采用Giemsa和Giemsa-Wright’s染色方法和血球计数板法，对黑水虻血细胞染色方法和血细胞数量及形态进行研究。结果表明，甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液染色9 min、pH 7.2磷酸盐缓冲液分色10 min是黑水虻幼虫血细胞最佳染色方法；黑水虻幼虫血细胞包括原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、类绛血细胞、珠血细胞5类；4龄黑水虻幼虫血细胞数量大约为2917个/μL，其中浆血细胞占53.20%±2.78%，粒血细胞占37.49%±3.96%，原血细胞占7.97%±1.51%，类绛血细胞占1.02%±0.24%，珠血细胞占0.62%±0.08%。Giemsa-Wright’s染色法为黑水虻幼虫血细胞最佳染色方法，黑水虻幼虫血细胞可分为5类10种。

黑水虻；血细胞；Giemsa-Wright’s染色法

黑水虻Hermetiaillucens(L.)是双翅目Diptera水虻科Stratiomyidae的一种重要资源昆虫，其幼虫能处理餐厨垃圾、死体畜禽、粪便等有机垃圾(Banksetal.，2014)。黑水虻营养价值高，尤其是脂肪含量，能作为饲料添加剂替代鱼粉等，用作生物柴油新型原料也具有其独特的优势(Lietal.，2011；陈晓伟等，2012；Henryetal.，2015)。作为水虻科的一类昆虫，黑水虻幼虫在自然界中常以腐烂有机物和动物粪便为食(安新城等，2007；柴志强等，2013)，像家蝇一般拥有强大的免疫能力，但黑水虻成虫不携带致病微生物，不传播疾病(徐齐云等，2014)，对家蝇种群有抑制作用(Bradleyetal.，1984)。宋明英(2013)等曾对黑水虻幼虫抗菌肽的诱导条件优化及粗提物活性做了初步研究，发现黑水虻幼虫能产生对大肠杆菌Escherichiacoil有强活性的抗菌肽；Park等(2014)和SI等(2015)发现低分子量的黑水虻幼虫提取物具有广谱抗菌活性，包括革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)，革兰氏阴性铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa。

昆虫血细胞作为其细胞免疫的主要执行者，能在天然免疫应答中发挥非常重要的作用，比如抵抗外源物时能实现吞噬、包囊、包被、凝集成瘤、形成结节等功能(张锡林等，2009)。果蝇Drosophilamelanogaster在遭受细菌、真菌和病毒等病原体攻击时，能通过细胞吞噬、集结、包囊作用以及产生抗菌肽等方式来清除入侵的微生物(李国辉等，2015)；3龄家蝇Muscadomestica幼虫离体血细胞在感染大肠杆菌之后，其浆血细胞、粒血细胞聚集成团能够将细菌包裹形成包囊，黑化(Yan，2010)。汪晓纯等(2014)在研究Notch信号途径中Su(H)和E(spl)基因对果蝇天然免疫的影响过程中发现，不同果蝇突变体中血细胞的噬菌功能和血细胞数量的变化不同。胡建等(2003)在观察亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis幼虫血细胞包囊行为时发现，亚洲玉米螟幼虫血细胞在体内外皆能黏附在外源物表面形成包囊，部分包囊会发生黑化现象。昆虫血细胞状态会随着昆虫生理环境的变化而发生不同程度的变化。杨志兰等(2013)发现，草地螟Loxostegesticticalis血细胞总数及各血细胞数量包括浆血细胞、粒血细胞会随幼虫密度的增加而显著递增。Sun等(2010)发现，斜纹夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)幼虫在取食不同镍含量的饲料之后血细胞凋亡率随着世代的增加发生不同变化；李艳敏等(2010)用含Cd2+饲料饲喂棕尾别麻蝇Boettcheriscaperegrine初产幼虫发现，重金属Cd2+对其血细胞具有毒害作用，包括细胞膜受损或破裂，染色质呈现凝聚,线粒体和内质网等细胞器明显减少，以及胞质内出现空囊泡。方旭(2015)研究表明，Zn2+胁迫能诱导黑水虻幼虫血细胞的凋亡，凋亡率随着世代的增加而增加，但该研究未涉及黑水虻血细胞类型的研究。关于黑水虻血细胞类型的研究国内外尚未见报道，本文运用Giemsa和Giemsa-Wright’s染色方法和血球计数板法，对黑水虻血细胞染色方法和血细胞数量及形态进行研究，以期为黑水虻细胞免疫研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黑水虻由四川农业大学农业昆虫与害虫防治实验室长期室内饲养。选取健康活跃、大小及生理状态一致的4龄黑水虻幼虫供试。

1.2 黑水虻血淋巴提取

将4龄黑水虻幼虫放置冰上麻痹，用75%酒精清洗体表，再用无菌水洗去酒精后擦干，剪去头部，每头幼虫用移液枪吸取血淋巴约15 μL，将4头幼虫血淋巴于1.5 mL离心管中混匀，置于冰上备用。

1.3 血细胞染色方法的筛选

Giemsa染色法：取血淋巴10 μL滴于干净载玻片上涂成血膜。待血膜干燥之后，用甲醇固定、Giemsa染液染色和pH 6.8磷酸缓冲液分色，用自来水冲洗，晾干封片，在Nikon80i光学显微镜下进行血细胞形态观察。

Giemsa-Wright’s染色法：按上述方法取血淋巴制成血涂片。待血膜干燥之后，用甲醇固定、Giemsa-Wright’s染液染色和pH 7.2磷酸缓冲液分色，用自来水冲洗，晾干封片。分别设置固定、染色和分色时间的不同处理，在Nikon80i光学显微镜下进行血细胞形态观察。

根据玻片血膜状态、核质着色情况、不同类型血细胞形态特征辨认出的细胞类型等，筛选出最适黑水虻血细胞的染色方法。

1.4 黑水虻血细胞数量及血细胞形态观察

1.4.1血细胞数量

取4龄黑水虻幼虫血淋巴，用血球计数板在普通光学显微镜下计数，统计5张以上血球计数板上细胞数量，取其平均值进行计算。

1.4.2血细胞类型观察

用筛选出的Giemsa-Wright’s染色法对血细胞形态观察。取黑水虻血淋巴制成血膜，待血膜充分干燥之后，用3-4滴甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液3-4滴染色9 min，再缓慢地滴加pH 7.2磷酸盐缓冲液分色10 min。自来水冲洗后，晾干封片，在光学显微镜下观察血细胞形态并拍照。每张玻片大约鉴定300个血细胞类型并计数，统计5张以上玻片血细胞类型。所有数据应用Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黑水虻血细胞染色方法筛选

Giemsa染色法需要时间较长、血细胞着色效果差，对黑水虻血细胞染色效果不佳。试验过程中染色时间分别为10 min、15 min、20 min、30 min的血细胞着色很淡，细胞质和细胞核之间的区分不明显，无法辨别血细胞类型；分别染色35 min、45 min、60 min的血细胞，虽然着色明显，但核质颜色区别不显著，无法辨别血细胞类型。

Giemsa-Wright’s染色法效果较Giemsa染色法好，染色时间短，细胞着色明显，细胞类型辨别清晰。不同的固定、染色和分色时间，血涂片呈现出不同染色效果，其中在甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液染色9 min，pH 7.2磷酸盐缓冲液分色10 min的条件下血膜完整、视野清晰，核质着色明显，能清晰辨认各种细胞类型，为黑水虻血细胞最佳染色方法(表1)。后续试验皆采用此方法。

2.2 黑水虻幼虫血细胞类型

通过Giemsa-Wright’s染色法观察发现，黑水虻幼虫血细胞(hemocyte)包括原血细胞(prohaemocytes)、浆血细胞(plasmatocytes)、粒血细胞(granulocytes)、珠血细胞(spherulocyte)和类绛血细胞(oenocytoid)5类。

2.2.1原血细胞

原血细胞是小型单核细胞，核大，有少量细胞质或者几乎没有细胞质，一般呈圆形，少数卵圆形，轮廓清晰，直径为7-9 μm。Giemsa-Wright’s染色中细胞核呈红紫色，细胞质呈淡蓝紫色或不见(图1.1、1.2a)。

2.2.2浆血细胞

浆血细胞是一类形态多样的中型细胞，有月牙形、不规则形、梭形，以卵圆形和圆形为主。卵圆形细胞平均大小约为15.7 μm×11 μm；圆形细胞直径大小约为12.9 μm。Giemsa-Wright’s染色下分为蓝紫核浆血细胞和红核浆血细胞，蓝紫核浆血细胞形状多为圆形、卵圆形，多为单核细胞，偶见双核，细胞核直径为7.6 μm。细胞质呈蓝色，含有少量大小均匀的微小颗粒。单核细胞核偏小，位于细胞中央；双核细胞核分布在细胞两端(图1.2b-1.6a)。红核浆血细胞轮廓模糊，单核，核大呈红紫色，核常偏离中央，细胞核直径约为8 μm，细胞质颜色为浅蓝色(图1.6b、1.7)。

2.2.3粒血细胞

粒血细胞多为圆形、卵圆形的中型单核细胞，细胞直径大小约为19.3 μm，核位于细胞中央，细胞核直径约为9 μm。在Giemsa-Wright’s染色下细胞核呈红紫色，细胞质蓝色，细胞质内含物呈现深蓝色。根据细胞中内含物颗粒大小，可分为小粒粒血细胞和大粒粒血细胞，小粒粒血细胞细胞质颗粒直径小于1 μm，小粒粒血细胞又分为稀少小粒粒血细胞(图1.8)和密集小粒粒血细胞(图1.9)；大粒粒血细胞细胞质内含物颗粒较大，颗粒直径约1-3 μm(图1.10)。

2.2.4类绛血细胞

类绛血细胞是一类较大型的血细胞，单核，核较小，平均细胞大小约为14.7 μm×21.5 μm，细胞核直径约为7 μm。在Giemsa-Wright’s染色，可分为红核和蓝核两种类型。红核类绛血细胞呈卵圆形，轮廓清晰，细胞核较大且常偏离细胞中央，呈现红紫色，细胞质蓝色、稠密，含多个有明显透亮的棒杆状内含物(图1.11、1.12)；另一类蓝核类绛血细胞细胞形态不规则，轮廓模糊，细胞核较小，位于细胞中央，呈深蓝色，细胞质稀疏，呈淡蓝色，细胞内不见明显内含物(图1.13)。

2.2.5珠血细胞

珠血细胞为中型单核圆形细胞，细胞直径大小约为15.3 μm，细胞核较大，细胞核直径约为8.3 μm，细胞质中含有大量的珠形内含物，珠粒透亮，大小基本均一且珠粒之间界限分明。珠血细胞可为红核珠血细胞(图1.14)和蓝紫核珠血细胞(图1.15)。

表1 不同条件下Giemsa-Wright’s染色法对黑水虻幼虫血细胞的染色效果

图1 Giemsa-Wright’s法黑水虻幼虫血细胞光学显微镜观察图Fig.1 The optical microscpe’s image of the hemocyte of Hermetia illucens (L.) by Giemsa-Wright’s method注：1.1、1.2a,原血细胞×600；1.2b-1.6a,蓝紫核浆血细胞×600；1.6b-1.7,红核浆血细胞×600；1.8,稀少小颗粒粒血细胞×600；1.9,密集小颗粒粒血细胞×600；1.10,大颗粒粒血细胞×600；1.11、1.12,红核类绛血细胞×600；1.13,蓝核类绛血细胞×600；1.14,红核珠血细胞×600；1.15,紫核珠血细胞×600；1.1,标尺=5 μm;1.2-1.14,标尺=10 μm。Note:1.1、1.2a, prohaemocytes×600; 1.2b-1.6a, blue-nucleus plasmatocyts×600; 1.6b-1.7, red-nucleus plasmatocyts×600; 1.8, the exiguous small granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.9, the dense small granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.10, the large granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.11、1.12, red-nucleus oenocytoid×600; 1.13, blue-nucleus oenocytoid×600; 1.14, red-nucleus spherulocyte×600; 1.15, blue-nucleus spherulocyte×600; 1.1, Scale bar=5 μm; 1.2-1.14, Scale bar =10 μm.

2.3 黑水虻幼虫血细胞数量及各类血细胞比例

用血球计数板计数表明，4龄黑水虻幼虫血细胞数量大约为2917个/μL；其中，通过染色观察发现数量最多的是浆血细胞，其次是粒血细胞、原血细胞和类绛血细胞，珠血细胞最少。各血细胞数量所占比例为：浆血细胞53.20%±2.78%，粒血细胞37.49%±3.96%，原血细胞7.97%±1.51%，类绛血细胞1.02%±0.24%，珠血细胞0.62%±0.08%。

3 结论与讨论

选择一种合适的染色方法处理血细胞来观察其形态，是研究昆虫血细胞过程中非常关键的一部分。Giemsa染色、Wright’s染色以及Giemsa-Wright’s染色等方法为昆虫血细胞研究中常用方法。不同染色法对不同昆虫血细胞染色效果不同，王世贵等(2007)用Giemsa染色观察红褐斑腿蝗Catantopspinguis血细胞并对其进行了分类；迟淑萍等(2004)运用Giemsa法观察了德国小蠊Blattellagermanica血细胞；贾雷坡等(2011)通过Wright’s染色对不同地区东亚飞蝗的血细胞进行了观察和分类；王强等(2011)分别用这3种方法染色中华稻蝗Qxyachinensis血细胞进行比较发现，Giemsa-Wright’s染色具备了另外2种染液的优点；殷培峰等(2014)运用Giemsa-Wright’s染色对金银花尺蠖HeterolochajinyinhuaphagaChu.幼虫血细胞的形态进行观察。本文筛选出了适合黑水虻幼虫血细胞观察的Giemsa-Wright’s染色法，染色时间短、核质区分明显、能够清晰辨别各种类型的血细胞，可用于黑水虻血细胞相关研究。

双翅目昆虫血细胞数量种间差异较大。家蝇3龄幼虫血细胞数量约为7090个/μL(刘晖，2008)；致倦库蚊Culexpipiensquinquefasciatus幼虫在发育的过程中，血细胞数量大约在1378-1814个/μL变化(莫非，2001)；桔小实蝇Bactroceradorsalis幼虫血细胞数量根据虫龄的变化更显差异，大约在45522.7-19086366.6个/μL(徐浪，2015)。本文中4龄黑水虻幼虫血细胞数量约为2917个/μL，与其他种类昆虫血细胞数量相比差异明显，但其血细胞数量在不同发育阶段变化还需进一步研究。

在双翅目昆虫血淋巴中，通常具有吞噬等作用的浆血细胞(傅贻玲，1982)所占比例很大，果蝇幼虫的浆血细胞占比达到90%-95%(Rizki，1957)，家蝇幼虫中浆血细胞占比在50%左右(刘晖，2008)。本研究发现黑水虻4龄幼虫中浆血细胞比例达到50%以上。但同一目昆虫中同类型血细胞比例是不尽相同的，比如家蝇粒血细胞占比为11.4%(刘晖，2008)，致倦库蚊粒血细胞比例高达40.3%(Brayner，2005)，埃及斑蚊的粒血细胞含量为16%(Araújo，2008)。据本试验统计结果，在黑水虻幼虫血细胞中粒血细胞所占比例为37%。

由于昆虫种类丰富，血细胞形态多样，且昆虫血细胞的形状常因观察时间和处理方法的不同而有较大差异，命名也颇不统一。尽管人类对昆虫血细胞的研究至今大约有340多年的历史，且涉及到的昆虫种类在100种以上(贾雷坡，2011)，但是血细胞的分类仍然是一个争议比较多的方面。目前普遍接受的是将其分为原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、类绛血细胞和珠血细胞 5种常见的血细胞类型(傅贻玲，1982)，但这些血细胞类型并不是同时存在所有昆虫中。在双翅目昆虫中，因为种属之间的差异，血细胞类型存在不同。目前人们普遍认同蚊类细胞主要包括为粒血细胞和浆血细胞、原细胞、球形细胞和类绛细胞；其中，杨松等(2004)通过Giemsa染色初步鉴定了大劣按蚊Anophelesdirus血细胞主要为颗粒细胞与浆细胞。莫非等(2001)将致倦库蚊C.quinquefasciatus幼虫的血细胞分为5种，即原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞和类绛血细胞；但Brayner等(2005)对Culexquinquefasciatus血细胞超微结构进行观察，发现了原血细胞、浆血细胞、珠血细胞、粒血细胞、类绛血细胞和脂血细胞(adipohemocytes)6种血细胞类型并对血细胞比例进行了统计；Araújo等(2008)发现埃及斑蚊Aedesaegypti除了拥有原血细胞、粒血细胞、浆血细胞和类绛血细胞4种常见血细胞类型以外还存在脂血细胞和拟血小板细胞(thrombocytoids)。对于果蝇Drosophilamelanogaster血细胞类型存在不同看法，谈娟(2011)认为果蝇血细胞主要有浆细胞、结晶细胞(crystal cell)和叶状血细胞(lamellocytes)3种，而Rizki(1957)则将其分为浆细胞、结晶细胞两大类以及其他变异类型足细胞(podocytes)。刘晖等(2008,2012)发现家蝇幼虫血细胞分为原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞5类，其中浆血细胞又分为大核浆血细胞和小核浆血细胞两种。

本文通过在Giemsa-Wright’s染色在黑水虻的血涂片中观察到了5类10种血细胞。其中，原血细胞和粒血细胞细胞核被染成红色，而浆血细胞、珠血细胞和类绛血细胞细胞核则都被染成红色和紫蓝色或蓝色两种类型。早在1966年就有科学家对昆虫血细胞之间相互演化关系进行研究，其观点认为浆血细胞是昆虫血细胞的基本形态，由原血细胞分裂演化而来；粒血细胞、类绛血细胞、足血细胞和蠕血细胞皆由浆血细胞发育形成；珠血细胞、囊血细胞是浆血细胞、粒血细胞形成；脂血细胞则是由粒血细胞而来(Gupta，1966)。贾雷坡等(2011)用Wright’s染色法观察东亚飞蝗血细胞，并提出其血细胞之间有如下演化关系：原血细胞是东亚飞蝗血细胞的干细胞，分裂和分化成浆血细胞，浆血细胞进一步演化为红核浆血细胞和蓝核浆血细胞2种类型，红核和蓝核浆血细胞各自分化和演化为粒血细胞和类绛血细胞。结合以上依据及本文中对黑水虻血细胞的观察认为，黑水虻血细胞可能存在以下演化关系：浆血细胞是由原血细胞分裂分化而来；浆血细胞分化为蓝紫核浆血细胞和红核浆血细胞，蓝紫核浆血细胞进一步演化为蓝紫核珠血胞和蓝紫核类绛血胞；红核浆血细胞进一步演化为红核粒血细胞、红核珠血细胞和红核类绛血细胞。其中，可能由于染色方法的不同本文中除了类降血细胞以外，两类红核、蓝紫核细胞并没有呈现纯正的对比颜色，但并不影响观察。更值得一提的是，在本文观察过程中并没有发现蓝核或者蓝紫核粒血细胞，其原因还需进一步研究。

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StudyonhemocytesclassificationofHermetiaillucens(L.)larve

MAO Min1, JIANG Chun-Xian1*, LIU Ming-Gang2, LI Qing1, YANG Qun-Fang1, WANG Hai-Jian1

(1.Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China；2.Zigong Plant Quarantine Station,Zigong 643000,Sichuan Province,China)

Hermetiaillucens(L.) is a kind of important resource insect. In order to lay the foundation for the research of Haemocyte immune functions ofH.illucens, the type, number and composition of the hemocytes of the 4thstage larva of theH.illucenswere studied by selecting suitable staining method which is beneficial to observe the hemocytes of 4thstage larva of theH.illucens. Hemocytes’s quantity and morphology of the 4thstage larva of theH.illucenswas researched by using Giemsa and Giemsa-Wright’s staining method and blood count plate. Fixing 4 min with Methanol, staining 9 min with Giemsa-Wright’s, separating color 10 min with pH 7.2 phosphate buffer is the best method. The hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenscould be divided into five types: prohemocyte, plasmatocyte, granulocyte, sphrulocyte and oenocytoid. The number of total hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenswas 2917/μL, and the percentage of prohemocyte, plasmatocyte, granulocyte, sphrulocyte and oenocytoid were about 7.97%±1.51%, 53.20%±2.78%, 37.49%±3.96%, 0.62%±0.08%, 1.02%±0.24%, respectively. Giemsa-Wright ’s method is the suitable method for hemocytes identification. The hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenscan be divided into five main types with ten subtypes.

Hermetiaillucensf; hemocyte; Giemsa-Wright’s method

毛敏,蒋春先,柳明刚,等.黑水虻幼虫血细胞类型的研究[J].环境昆虫学报，2017,39(6):1342-1349.

Q965

A

1674-0858(2017)06-1342-08

四川农业大学双支计划

毛敏，女，1993年生，在读硕士研究生，研究方向为农业昆虫与害虫防治，E-mail：15573831671@163.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: chunxianjiang@126.com

Received: 2016-07-06; 接受日期Accepted: 2016-08-27