miR-222通过MMP1对增生性瘢痕成纤维细胞的调控机制研究

张谊 张璃 张启瑜 洪炜龙 林孝华

●论 著

miR-222通过MMP1对增生性瘢痕成纤维细胞的调控机制研究

张谊 张璃 张启瑜 洪炜龙 林孝华

目的 观察成纤维胶原酶1（MMP1）和miR-222在增生性瘢痕（HS）成纤维细胞中的表达水平，探讨miR-222对HS发生、发展的调控机制。方法 选取36例HS患者的HS组织，并各留取HS旁正常组织作为对照。分离培养出HS组织与正常组织的成纤维细胞；采用RT-PCR法检测成纤维细胞MMP1 mRNA和miR-222表达水平；采用Western blot法检测成纤维细胞MMP1蛋白表达水平；采用MTT法检测成纤维细胞增殖情况；采用双荧光素酶报告实验检测miR-222是否可调控MMP1基因。结果 与正常组织比较，HS组织成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平均下调（均P＜0.05），miR-222表达水平上调（P＜0.05）。与空白对照成纤维细胞比较，HS组织转染MMP1过表达质粒后的成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平均上调（均P＜0.05），增殖速度明显减慢（P＜0.05）；转染antagomiR-222质粒后的成纤维细胞miR-222表达水平下调（P＜0.05），MMP1 mRNA表达水平上调（P＜0.05），增殖速度明显减慢（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果表明miR-222能与MMP1基因的3′-UTR区相结合，从而调控其表达。结论 miR-222在HS组织中存在过表达，miR-222或通过负调控其靶基因MMP1的表达而发挥其调控成纤维细胞增殖和凋亡的作用。

增生性瘢痕 microRNA-222 基质金属蛋白酶1

皮肤创伤后常因胶原沉积和降解失衡形成增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）。基质金属蛋白酶（MMPs）可降解细胞外基质（ECM）和胶原，在细胞对外环境刺激的反应中起重要作用。MMPs不仅可以水解蛋白质，阻断ECM的合成，还能调控细胞间或细胞与外环境间的相互作用[1]。MMP1又称成纤维胶原酶1，是皮肤胶原降解的关键酶，在HS的形成中起重要作用[2]。microRNA（miR）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，上调相应microRNAs抑制MMP1表达可影响皮肤的纤维化[3]。研究发现，miR-222的作用靶点为MMP1，可调控舌鳞状癌细胞的生物功能[4]。目前，miR-222在HS组织成纤维细胞中的调控作用报道少见。本研究旨在观察MMP1和miR-222在HS组织成纤维细胞中的表达水平，探讨miR-222对HS发生、发展的调控机制，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年8月至2016年5月在本院确诊的HS患者36例，其中男20例，女16例；年龄17～61岁，中位年龄45.6岁。患者均无激素、中药使用史及放、化疗史；HS均由烧伤所致，符合POSAS标准[5]。

1.2 试剂和仪器 miRcute miRNA分离/荧光定量试剂盒（TIANGEN公司），miRcute miRNA cDNA/TIANScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN公司）；qRTPCR仪（美国Bio-Rad公司），GloMax 20/20光度计（Promega公司），Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega公司），MMP1一抗（Abcam 公司），β-actin（Abcam公司），二抗（Abcam公司），Trizol试剂（翊圣生物公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（中科瑞泰公司），细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（MTT法）（基尔顿生物公司），质粒/siRNA/agomiR（上海生工生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 在患者瘢痕切除手术后，从术中切除标本中切取HS组织和HS旁正常组织，液氮保存。检测时将组织转入装有液氮的研钵中，磨成粉末，收集到EP管用于提取mRNA和蛋白。

1.3.2 成纤维细胞分离培养 0.1mol/L PBS冲洗HS组织及正常组织3次，剪除碎屑和表皮；0.25%Dispase过夜消化，分离表皮。剪碎组织至肉泥状，0.1%Ⅰ型胶原酶溶液37℃振荡消化180min。以等量体积含10%FBS的 LG-DMEM培养液终止消化，1 200rpm离心10min，弃去上清液，获得细胞团，高糖培养液重悬，以4×104个/cm2密度接种于培养皿，37℃、5%二氧化碳、100%湿度条件下培养，24h后第1次换液，以后隔日换1次，待细胞长成单层后消化传代。

1.3.3 RT-PCR法检测MMP1 mRNA和miR-222表达水平 每100mg组织加入1ml Trizol裂解，酚氯仿法抽取总RNA，凝胶电泳检测RNA条带的完整性，测量RNA 260/280的比值检测RNA纯度，取总RNA 1μg进行逆转录，模板cDNA-20℃保存。MMP1上游引物：5′-ATTCTACTGATATCGGGGCTT TGA-3′，下游引物：5′-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3′。miR-222 上游引物：5′-CGCAGCTACATCTGGCTACTG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGT CCGAGGT-3′。GAPDH 上游引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。采用 2-ΔΔCt法计算，与GAPDH比值作为mRNA表达水平。

1.3.4 Western blot法检测MMP1蛋白表达水平 每100mg组织加200μl蛋白裂解液，冰上裂解30min。12 000rpm，4℃离心15min，取上清液。用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白样品浓度后，加SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5min。取20μg蛋白质，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰浴下100V恒压转膜2h，5%脱脂牛奶室温封闭 1h，加 MMP1 一抗（1∶500），β-actin（1∶5 000）4℃孵育过夜，二抗（1∶3 000）室温孵育 1h。将膜置于ECL发光液中反应，于凝胶成像系统中曝光，用image lab 3.0软件获取图像并分析，用目的蛋白条带的灰度值与内参β-actin条带的灰度值之比为作为目的蛋白的表达水平。

1.3.5 MTT法检测成纤维细胞的增殖情况 采用脂质体法为成纤维细胞转染MMP1过表达质粒pcdna，并设置空白对照。转染质粒后将待检测细胞按2×103/孔密度种在96孔板上，每孔设3个复孔，分别在24、48、72h加入20μl浓度5g/L MTT，最后1d加入150μl DMSO溶解紫色结晶，37℃孵育4h后在490nm波长处测吸光度，绘制细胞增殖曲线。

1.3.6 双荧光素酶报告实验用miRanda、TargetScan、PiTa、RNAhybrid和PICTA等靶基因预测软件检索调控MMP1的基因，发现miR-222可能调控MMP1基因，见图1。合成MMP1基因的3′-UTR区的miR-222正常种子区，在两端加上Spe-1及HindⅢ酶切位点，将DNA片段克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告质粒上。用脂质体法将带有3′-UTR DNA序列的0.8μg的质粒转染原代成纤维细胞，然后转染antagomiR-222（100nmol/L）培养24h，裂解细胞，测荧光值。以Renilla荧光活性为内参。

图1 miR-222可能是调控MMP1基因

1.4 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用配对t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HS组织与正常组织成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平比较 见图2。

图2 HS组织与正常组织成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平比较（a∶mRNA；b∶蛋白；与正常组织比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图2可见，HS组织与正常组织成纤维细胞MMP1 mRNA 表达水平分别为 0.31±0.12、1.00±0.19，MMP1 蛋白表达水平分别为 0.48±0.02、1.00±0.12。与正常组织比较，HS组织成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平均下调（均P＜0.05）。

2.2 HS组织成纤维细胞转染MMP1过表达质粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表达水平及增殖速度与空白对照成纤维细胞比较 见图3、4。

图3 HS组织成纤维细胞转染MMP1过表达质粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表达水平与空白对照成纤维细胞比较（a∶mRNA；b∶蛋白；与空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图3可见，HS组织成纤维细胞转染MMP1过表达质粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表达水平分别为3.81±0.32、2.04±0.26，空白对照成纤维细胞的 MMP1mRNA、蛋白表达水平分别为 1.00±0.10、1.00±0.17。与空白对照成纤维细胞比较，HS组织转染MMP1过表达质粒pcdna后的成纤维细胞MMP1 mRNA、蛋白表达水平均上调（均P＜0.05）。由图4可见，与空白对照成纤维细胞比较，HS组织转染MMP1过表达质粒pcdna后的成纤维细胞48、72h的增殖速度均明显减慢（均P＜0.05）。

2.3 HS组织与正常组织成纤维细胞miR-222表达水平比较 见图5。

图4 HS组织成纤维细胞转染MMP1过表达质粒pcdna后的增殖速度与空白对照成纤维细胞比较（与空白对照比较，*P＜0.05）

图5 HS组织与正常组织成纤维细胞miR-222表达水平比较（与正常组织比较，*P＜0.05）

由图5可见，HS组织与正常组织成纤维细胞miR-222 表达水平分别为 2.51±0.22、1.00±0.09。与正常组织比较，HS组织成纤维细胞miR-222表达水平明显上调（P＜0.05）。

2.4 双荧光素酶报告实验结果 共转染antagomiR-222和pMIR-REPORT质粒后的成纤维细胞荧光值低于与空白对照的成纤维细胞（P＜0.05），表明miR-222能与MMP1基因的3′-UTR区相结合，从而调控其表达。

2.5 HS组织成纤维细胞转染antagomiR-222质粒后miR-222、MMP1 mRNA表达水平及增殖速度与空白对照成纤维细胞比较 见图6、7。

由图6可见，HS组织成纤维细胞转染antagomiR-222质粒后miR-222、MMP1 mRNA表达水平分别为0.40±0.22、1.86±0.59，空白对照成纤维细胞 miR-222、MMP1 mRNA 表达水平分别为 1.00±0.09、1.02±0.07。与空白对照成纤维细胞比较，HS组织转染antagomiR-222质粒后的成纤维细胞miR-222表达水平下调（P＜0.05），MMP1 mRNA 表达水平上调（P＜0.05）。由图 7可见，与空白对照成纤维细胞比较，HS组织转染antagomiR-222质粒后的成纤维细胞48、72h的增殖速度均明显减慢（均 P＜0.05）。

图6 6 HS组织成纤维细胞转染antagomiR-222质粒后miR-222、MMP1 mRNA表达水平与空白对照成纤维细胞比较（与空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

图7 HS组织成纤维细胞转染antagomiR-222质粒后增殖速度与空白对照成纤维细胞比较（与空白对照比较，*P＜0.05）

3 讨论

瘢痕挛缩可影响肢体或器官的功能。目前临床对伤口的处理主要是促进伤口愈合和抑制瘢痕过度形成，尚无既可促进伤口愈合又可阻止瘢痕过度形成的有效处理方法。HS的病理特征是成纤维细胞过度增生和细胞外胶原过度沉积。HS发病机制尚不清楚，其形成的主要原因是细胞外胶原合成和分解平衡紊乱。MMPs是降解ECM的主要蛋白酶，抑制MMPs的活性和表达会导致一系列以ECM沉积为主要特点的疾病，如结缔组织病，器官纤维化和动脉硬化等。MMP1是皮肤胶原蛋白降解的关键蛋白酶[6]。MMP1的激活受多种因子的调控，使ECM处于动态平衡中，MMPs活性增强或降低都会破坏ECM的动态平衡，当这一动态平衡打乱将导致胶原降解不足和ECM过度沉积，从而导致纤维化[7]。本研究结果显示，MMP1 mRNA、蛋白在HS组织成纤维细胞中表达下调，转染MMP1过表达质粒后成纤维细胞增殖能力显著下降。

microRNAs在纤维化疾病中发挥重要作用，并有可能成为治疗纤维化疾病的靶点[8]。有研究通过对比HS组织与正常皮肤组织中的microRNAs的表达，证实有百余种microRNAs存在差异性表达[9]。这提示microRNAs在瘢痕的发生、发展中发挥重要作用。根据靶基因预测软件检索结果，发现miR-222是可能调控MMP1的基因。miR-222在多种疾病及多种组织中存在异常表达。然而miR-222在HS组织的表达情况报道少见。本研究首次发现HS组织成纤维细胞miR-222表达水平较正常组织成纤维细胞显著上调，提示miR-222在HS中可能发挥了一定的调控作用。然后，本研究通过双荧光素酶报告实验发现，miR-222确实是调控MMP1的基因，miR-222能与MMP1的3′-UTR区相结合，从而调控其表达。

目前有关miR-222的研究主要集中于肿瘤领域，miR-222发挥促癌作用或抑癌作用[10-11]。miR-222在HS组织中的功能尚不明确。本研究结果发现，miR-222起促进成纤维细胞的增殖的作用；抑制miR-222的表达，MMP1表达水平上调，成纤维细胞增殖速度下降，证实miR-222可通过调控MMP1的表达，进而发挥调控成纤维细胞增殖和凋亡的作用。

综上所述，本研究结果发现miR-222在HS组织存在过表达，miR-222或通过负调控其靶基因MMP1的表达而发挥其调控成纤维细胞增殖和凋亡的作用。本研究为miR-222/MMP1信号通路可能为HS诊断和治疗新的生物标记物和治疗靶点提供参考。

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MicroRNA-222 regulates the proliferation of fibroblasts in hypertrophic scar via matrix metalloproteinase 1

ZHANG Yi,ZHANG Li,ZHANG Qiyu,et al.
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To determine the expressions of matrix metalloproteinase 1(MMP1)and miR-222 in fibroblasts of hypertrophic scar(HS),and investigate the regulatory mechanism of miR-222 on the occurrence and development of HS.Methods HS tissues and HS-adjacent normal tissues were both collected from 36 HS patients.Primary fibroblasts were obtained.qRT-PCR was used to measure the level of mRNA of MMP1 and miR-222.Western blotting was carried out to determine MMP1 protein expression.MTT assay was employed to detect the proliferation of fibroblasts.Dual luciferase reporter assay was performed to identify the binding of miR-222 with MMP1 mRNA.Results MMP1 mRNA/protien were significantly downregulated and miR-222 was significantly upregulated in HS fibroblasts,compared with control fibroblasts(P＜0.05).The expression of MMP1mRNA/protein were significantly upregulated(P＜0.05),and the cell proliferation abilities was significantly inhibited in HS fibroblasts after transfected with pcDNAMMP1(P＜0.05).miR-222 was downregulated(P＜0.05),MMP1 mRNA was upregulated and the cell proliferation abilities was inhibited(P＜0.05)in HS fibroblasts after transfected with antagomiR-222,Dual-Luciferase Reporter assay showed miR-222 regulated the expression of MMP1 by binding with its 3′-UTR. Conclusion miR-222 overexpressed in HS fibroblasts,miR-222 may regulate the proliferation and apoptosis of fibroblasts in HS via negatively regulating the expression of target gene MMP1.

Hypertrophic scarMicroRNA-222 Matrix metalloproteinase 1

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-823

浙江省医药卫生项目（2015KYB244）

325000 温州医科大学附属第一医院皮肤科（张谊、张璃、林孝华），肝胆外科（张启瑜），外科实验室（洪炜龙）

林孝华，E-mail：wzlinxiaohua@163.com

2017-04-12）

李媚）