注射剂中热原在线检测仪及应用

李存玉, 彭国平, 郑云枫, 潘林梅

(南京中医药大学 药学院, 江苏 南京 210023)

注射剂中热原在线检测仪及应用

李存玉, 彭国平, 郑云枫, 潘林梅

(南京中医药大学 药学院, 江苏 南京 210023)

针对实验教学中热原检测周期长、不便于开展实体教学的问题,为了启发大学生创新实践能力,以学生为主体的研发小组研制一种可实现热原在线监控的装置。该装置基于热原的光散射特征,在注射剂生产过程中通过密闭管路与生产线对接,杜绝了检测环境中微粒悬浮物对检测过程的污染,实现了热原快速、在线、无污染检测。该装置的研发充分发挥了学生的潜力与创造性,实现课堂教学效果与实践能力的双提升。

热原； 在线检测； 实验教学； 创新能力

中药制药行业中对于药品的安全性控制尤为重视,特别是注射剂。因采用静脉注射进入血液,因而对引起不良反应的有害物质的多采用限量控制。热原的检测控制方法分为家兔法和动态浊度法,家兔法是根据动物体温波动评价制剂安全性,动态浊度法是根据热原中的主要成分细菌内毒素与鲎试剂反应产生的量化关系进行限量评价。两种方法在具体的实验教学过程中均具有一定的局限性,家兔法实验周期较长且对动物稳定性要求高[1],学生难以获得有效数据;动态浊度法实验操作周期长，试剂成本偏高,且对操作要求较高[2]。目前在中药制药专业综合实验中通过虚拟仿真系统开展教学,但是对于学生的技能操作培养有所欠缺。

注射剂安全性控制中热原的限度要求与其临床安全性直接相关,而且制剂生产过程中热原污染也存在突发性、偶然性[3],因此如何实现生产过程在线控制是提升注射剂安全性的关键。为了提升教学效果、锻炼中药制药专业学生的自主创新能力,通过学生自愿申报进入中药制药实验室课题组,由指导教师引导、学院实验中心提供科研平台,开展注射剂中热原在线监控装置研发。

1 热原

热原(pyrogen)又称细菌内毒素(bacterial endotoxin),是革兰氏阴性菌细胞外壁的脂多糖[4-5],结构为一端是疏水的酯链,另一端是亲水的糖链。类似表面活性剂的结构特点使细菌内毒素在水溶液中多以团聚态胶体的形式存在[6],在水溶液中呈现出纳米胶粒子的光散射特征,可通过纳米粒子检测装置直接检测。同时,中药制剂中成分普遍偏低,其粒径分布与细菌内毒素有明显差异,通过优选检测参数进行区分,从而实现细菌内毒素快速、在线、无污染检测,基于此常规的激光粒径检测设备开展教学用热原在线检测装置研制。

2 检测原理

传统的衍射和散射原理的激光粒度仪测试亚微米级范围的颗粒,由于其散射光信号的空间分布趋于一致,其分辨率很低,如果采用偏振光、双光源、双镜头等信号的信噪比也偏低,达不到测试纳米的分辨率和精度。激光照射到颗粒产生的散射光的强度因颗粒的布朗运动而发生变化。这种光强与颗粒的粒径相关。通过探测器(常用光电倍增管)在特定光学结构下,将这一起伏涨落的光强转化为电信号,经自相关运算得到相关曲线,再由专用软件分析出平移扩散系数,最后经Stoken-Einstein公式,计算出粒度分布[7-9]。

3 激光粒径检测仪改造

3.1 热原在线检测构造

热原在线检测仪的内部结构见图1，主要由光学系统、数据处理系统和预警系统组成。光学系统包括平行双激光源、短焦透镜、光栅、长焦透镜、光栅滤波器和多点散射光接收器；数据处理系统包括光电转换器、信号放大器、信号处理器、数据采集器、粒子辨识及定量运算器和数据显示器；在线及预警系统包括在线流动检测池、超声探头和报警器。

图1 热原在线检测仪内部结构示意图

3.2 技术性能

结合中药制药专业综合实验的主体内容[10],以丹参注射液生产线检测为例,进行以内毒素在线监测为目标的新型内毒素检测仪器的样机开发,对其性能进行全面考察,检验仪器性能与在线监控的可行性,并设定一系列指标,以反映仪器应用性能,保证仪器检测结果的可靠性。

3.2.1 技术性能

检测不消耗试剂,对药液无任何污染,可以对制剂中的内毒素浓度实现半定量检测,并与中药成分进行有效区分,以及检测微生物的污染；在3 min内可以完成样品取样、检测、结果输出;仪器可实现连续检测,并通过预警曲线反映制剂中细菌内毒素的水平,其检测最低限度达到0.50 EU/mL,以确保制剂内毒素含量在安全范围之内。

3.2.2 技术参数

适用范围:注射用水或注射剂生产的在线监控,离线快速检测,注射剂生产设备的洁净度监控、超滤膜完整性检测等。技术参数见表1。

表1 技术参数

3.3 研制方法

3.3.1 在线检测技术改进

检测池的优化：实现生产线的同步连接、监控,增加了超声混匀装置,使检测溶液均匀混合,检测结果更准确,富有代表性。根据注射剂品种设置采样点间隔,关闭进液口和出液口,使待检测溶液呈现静止状态,对注射剂内毒素污染状况进行监控。通过在线检测池与生产线的对接,实现对注射剂生产线的在线检测(见图2)。

图2 在线检测示意图

3.3.2 检测专属性

光源采用波长632.8 nm的He-Ne激光器,只选择颗粒真正产生的单散射信号部分,去除干扰信号,激光源在降低对样品热效应的同时,加大功率,并针对样品,选择合适的发射功率,自动调节激光衰减；散射光接收器为光电二极管(APD)检测器,多角度多点接收,暗基数小,灵敏度高,速度快,性能稳定,通过光电二极管将散射光信号接收并转换成电信号,并配有相应的电信号放大器。数据处理器是将光强转化为电信号,经运算得到相关曲线,再由数据分析软件计算出平移扩散系数,最后经Stokes-Einstein公式,计算出粒径分布。

4 测定结果及可行性分析

4.1 检测结果

对所研制的热原在线检测仪进行细菌内毒素的检测限实验,采用注射用水清洗检测器的循环检测管路以及检测池,进而采用临床常用注射液——丹参滴注液为例进行设备的功能性验证。以丹参滴注液为空白,并分别加入细菌内毒素工作标准品,配制成浓度为0.25、0.50、5.00、25.00 EU/mL的细菌内毒素溶液进行检测,测定结果见图3—图7。

由于细菌内毒素在溶液中是以团聚状态存在,其粒径大于丹参成分的粒径分布,而仪器的检测原理是以溶液中颗粒的体积进行数据模型转换成粒径,所以细菌内毒素的粒径分布强度将丹参滴注液中成分的粒径分布峰掩盖[11]。

丹参滴注液中加入细菌内毒素后,粒径分布峰有明显变化,当内毒素浓度降低时,内毒素是以低分子量团聚态存在,随着浓度升高,逐步呈现出高分子团聚态,浓度与粒径分布呈现出一定的相关性,也为热原的在线检测提供了可行性。图5中粒径分布细菌内毒素检测限已达到0.50 EU/mL,可以满足丹参滴注液中细菌内毒素的限度检测要求。

图3 丹参滴注液粒度分布

图4 0.25 EU/ml细菌内毒素污染粒度分布

图5 0.50 EU/ml细菌内毒素污染粒度分布

图6 5.00 EU/ml细菌内毒素粒径污染粒度分布

图7 25.00 EU/ml细菌内毒素污染粒度分布

4.2 检测结果的重现性

以丹参滴注液为例,依据图2的在线检测装置连接内毒素检测系统与药液管路,对细菌内毒素污染后的丹参滴注液进行检测,测试不同污染条件下滴注液中细菌内毒素污染特征峰分布,多次进行重复试验,测定结果见表2。在不同内毒素污染环境下的丹参滴注液粒径分布的D50(累计粒度分布百分数达到50%时所对应的粒径)的RSD均低于4%,结果较稳定,数据重现性好。

表2 不同内毒素污染的丹参滴注液粒径分布

4.3 误差分析

研发的热原在线检测仪旨在拓展中药制药专业对注射剂生产过程的控制,开发学生的创新实践能力。初步构建的在线检测系统不可避免地存在检测误差,可能导致误差的原因有:检测环境的洁净度对检测结果的影响,空气中悬浮微粒的介入导致粒径出现突发性的增长；注射剂中成分的干扰,目前发现皂苷类成分与内毒素的粒径特征存在相似性,分析原因是其在溶液中因表面活性以胶束状态存在,从而引起检测误差的出现。

5 热原在线检测仪器的创新性

(1) 新颖的检测原理。利用激光散射检出细菌内毒素胶体特征而研制的内毒素新型检测仪,具有能快速检测及在线检测的优势,弥补了现有热原检测技术的缺陷,可通过进一步设备优化实现注射液生产过程中的内毒素在线检测,有效控制微生物在生产线中的污染问题,提升注射剂安全性。

(2) 检测过程无污染。不需要添加检测探针,针对细菌内毒素不同浓度的粒径分布区别可以实现半定量检测,避免了检测试剂的消耗。同时,在生产过程中通过密闭管路与生产线对接,杜绝了检测环境中微粒悬浮物对检测过程的污染。

(3) 数据在线分析。因检测原理不同,避免了传统检测方法需离线分析的问题,通过与在线生产管路直接对接,实时分析注射剂中细菌内毒素的污染情况,符合“药品质量是生产出来的而不是检验出来的”药品生产管理要求与理念,解决注射生产过程因微生物污染而带来的不明不良反应等安全性问题。

6 创新实践能力锻炼

热原在线检测仪的研发是起始于满足专业实验的检测需求。该热原在线检测仪的研制成功,丰富了小组成员在物理化学专业知识，锻炼了制药领域创新能力,所研发的热原在线检测仪器通过委托加工的方式,进行了设备组装,并申请了专利保护。以此为切入点，参加了挑战杯全国大学生课外学术作品竞赛并获得特等奖,目前研发的热原在线检测设备已在中药制药专业综合实验得到应用,学生根据专业特长及其个人爱好,对设备的硬件及其检测软件进行了优化。该研制以制药过程中存在的问题为导向,发挥专业特色、解决实际问题为出发点的大学生实践创新能力锻炼,不仅为现代大学生的培养提供了基础,也为科学合理的教学改革指引了方向[12-13]。

7 结语

教学用热原在线检测仪的研发是以解决实际生产中存在的技术难题为出发点,结果快速、稳定,不仅提高了检测效率,而且有效提升了注射剂生产技术水平,保障了制剂安全性。利用该装置多次开展注射用水、丹参滴注液中内毒素污染水平在线监控,测定结果表明,误差小于5%,结果重现性好。此外,通过采用经典的鲎试剂动态浊度法验证了结果准确可靠。目前虽然中药注射剂中皂苷类成分对检测结果产生影响,后续仍对针对内毒素结构与光散射特征的相关性展开研究,以期提升设备检测的专属性。

该设备满足了中药制药专业实验教学需求,实现了“从学生中来、到学生中去”的启发式实验教学设备研发思路。在教学过程中,本专业前辈学长的科研精神激励学生自发地开展实验教学改革创新,实验教学中心提供科研平台,从而有效促进了学生自主研发能力,锻炼了学生的综合素质。

References)

[1] 张媛,钱德明,刘群丽,等.热原检查实验次数对家兔致热灵敏度的影响[J].中国药事,2012,26(2):152-154.

[2] 杨胜富,覃芳,陈飞.动态浊度法定量测定复方丹参注射液和丹参注射液中的细菌内毒素[J].中药材,2016,39(3):590-592.

[3] 支兴蕾,李存玉,李红阳,等. 含黄芩苷注射剂中突发性热原污染的去除研究[J].南京中医药大学学报(自然科学版),2013,29(6):567-571.

[4] Grisman S E, Hornick R B. Comparative pyrogenic reactivity of rabbit and man to bacterial endotoxin[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1969, 131(4):1154-1158.

[5] Sasaki S. Biological activity of lipopolysaccharides isolated from bacteria in human periodontal lesions[J]. Bull Tokyo Dent Coll, 1979, 20(4):159-174.

[6] Yosuke S, Reiko F, Ikuo I, et al. Removal of Endotoxin from Water by Microfiltration through a Microporous Polyethylene Hollow-Fiber Membrane[J]. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(4):813-820.

[7] 李向召,谢康,黄志凡,等.激光粒度仪的技术发展与展望[J].现代科学仪器,2009(4):146-148.

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[10] 李存玉,彭国平.中药制药综合实验教程的探索与建设[J].中医教育,2015,34(4):4-7.

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[12] 陈发堂,熊慧萍,陈东生.加强自制仪器的研发实现创新能力的培养[J].实验室研究与探索,2009,28(2):46-47,51.

[13] 李勇军,张海燕.大学生创新能力训练模式探索与实践[J].实验技术与管理,2014,31(11):17-19.

On-line detector for pyrogen in injection and its application

Li Cunyu, Peng Guoping, Zheng Yunfeng, Pan Linmei

(College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

In view of the problems that the detection cycle of pyrogen is long and it is difficult to carry out solid experimental teaching, and in order to enlighten the college students’ innovative awareness, a device which can realize the on-line monitoring of pyrogen is developed by the student R&D group. The device is based on the light scattering characteristics of pyrogen, and in the process of injection production, the pollution by the suspended particulate matter in the detection environment is eliminated through the connection between the sealed pipeline and the production line, and the rapid, on-line and non-pollution detection of pyrogen is realized. The R&D of the device can give full play to the students’ potential and creativity, and realize the double promotion of classroom teaching effect and practical ability.

pyrogen; on-line detection; experimental teaching; innovative ability

10.16791/j.cnki.sjg.2017.12.024

2017-06-01

国家自然科学基金项目(81503258)；江苏省高等教育教改研究立项课题基金项目(2013JSJG036)；南京中医药大学教师教学发展课题基金项目(NZYJSFZ2016-05)

李存玉(1985—),男,江苏徐州,博士,讲师,研究方向为中药制药工艺研究

E-mail：licunyuok@163.com

彭国平(1963—),男,江苏金坛,博士,教授,博士生导师,研究方向为中药注射剂安全性评价等.

E-mail：guopingpeng@126.com

R917

A

1002-4956(2017)12-0097-05