液相色谱串联质谱法测定白菜中的甲醛含量

顾亚萍，乔方，方长发，胡祥娜，王瑞，林慧纯，张士瑞，禹绍周，张晓强

1(深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳，518040) 2(深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院， 广东 深圳， 518055)

液相色谱串联质谱法测定白菜中的甲醛含量

顾亚萍1，乔方2*，方长发2，胡祥娜1，王瑞1，林慧纯1，张士瑞1，禹绍周1，张晓强1

1(深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳，518040) 2(深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院， 广东 深圳， 518055)

文中使用2,4-二硝基苯肼衍生法使白菜中甲醛生成甲醛-2,4-二硝基苯腙，再使用乙腈提取富集甲醛-2,4-二硝基苯腙(衍生物)，后经液相色谱串联质谱对其浓度进行检测。结果显示，该法中甲醛的检出限为3.06 μg/kg，当白菜中甲醛添加含量在1～18 mg/kg时，甲醛线性良好(r2=0.994)。对白菜中3种浓度(0.5、1、5 mg/kg)甲醛添加进行6次平行回收实验，结果表明，3种浓度平行添加回收率在102%～105%，相对标准偏差为3%～8%，回收稳定，精密度良好。

液相色谱串联质谱；白菜；甲醛；2,4-二硝基苯肼

自2012年有媒体报道甲醛浸泡白菜或喷洒白菜以延长保存期以来，消费者对白菜的食用担忧很大。但作为非法添加的甲醛浓度测量，相关检测方法却缺失。一般都是参考其他的标准方法进行检测[1-5]。

甲醛的测定按使用仪器分类，主要有分光光度法、液相色谱法、气质法等。其中，分光光度法测定的是醛类的总和，因而结果会比实际添加值高[6]；液相色谱法，虽然可以使用液相色谱柱分开各种醛类，但白菜基质复杂，紫外下干扰物质较多 ,影响检测基线和和低浓度时甲醛的定量[7-10]。气质法干扰少，应用前景广，但前处理时间长，步骤繁琐[11-12]。

此外，样品处理过程也是影响甲醛测定的一个重要因素。现有的研究中衍生法最为简单，即Nash试剂(乙酰丙酮)法[4,13]、苯肼法[3,5,14-15]和五氟苄基羟基胺盐法[16-17]。其中，Nash法的的反应物和产物易溶于水，更加适合于啤酒等液体类样品的测定。五氟苄基羟基胺盐法中反应物价格昂贵，主要用于气体中恒量甲醛的测定。而苯肼法是食品中甲醛测定的最佳衍生物，其反应物2,4-二硝基苯肼和产物苯腙溶于乙腈，衍生时间短，可通过氮吹方式置换试剂，使其同时适合气质、液质的检测。

本文在原苯肼法的基础上，用乙腈提取衍生化产物甲醛-2,4-二硝基苯腙，再结合高效液相色谱串联质谱联用仪对甲醛-2,4-二硝基苯腙含量进行测定，前处理方法简单，与液相色谱法相比，由于使用母离子和二级离子的2次筛选，因而干扰物更少。方法回收稳定，精密度好。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪，XEVO TQ-S(WATERS公司，美国)，软件为Masslynx；Millipore纯水机，Elix5(Millipore公司，美国)；旋涡混合器，XH-B(江苏省姜堰市康健医疗器具有限公司，中国)；台式高速离心机，TG16G(湖南凯达科学仪器有限公司，中国)；超声波清洗器，AS30600BDT(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；恒温水浴摇床，WNE10(MEMMERT，美国)；电子天平，BS200S-WE1(Sartorius，德国)；营养调理机，CBS2061E(艾美特有限公司，中国)。

2,4-二硝基苯肼和甲醛-2,4-二硝基苯腙均为分析纯，购自Sigma公司；甲醛标准品购自广州奥谱析有限公司；乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；NaCl为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。甲酸和乙酸铵为优级纯，购自上海安谱科学仪器有限公司；乙酸钠和冰乙酸均为分析纯，购自Sigma上海安谱科学仪器有限公司；实验用水为自制超纯水。

实验用白菜购自市场。

样品提取液上机前经0.22 μm的PTFE滤膜过滤至2 mL HP小瓶中，滤膜和HP小瓶均购自安捷伦科技有限公司。

1.2 溶液的配置

2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼300 mg，用乙腈溶解定容至500 mL，避光保存，现配现用。

缓冲溶液(pH 5)：称取2.64 g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。

甲醛标准溶液：100 μg/mL,安培瓶封装，置于10 ℃以下保存。使用前与室温平衡，摇动均匀，打开后转移至棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛工作液：将甲醛标准溶液用水稀释至10 μg/mL后转移至棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛质控标准溶液：分别为0.671和0.809mg/mL，安培瓶封装，置于10 ℃以下保存。使用前与室温平衡，摇动均匀，准确量取1 mL转移至10 mL容量瓶中用水定容，混匀后置于棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛-2,4-二硝基苯腙标准溶液：1 000 μg/mL,安培瓶封装，置于10 ℃以下保存。

甲醛-2,4-二硝基苯腙工作溶液：200 μg/mL。甲醛-2,4-二硝基苯腙标准溶液于室温平衡，摇动均匀，打开后准确量取1 mL转移至5 mL容量瓶中，混匀后置于棕色瓶密封0～5 ℃保存。

1.3 样品处理

使用营养调理机将白菜充分搅碎并混匀，样品置于塑料样品碗中冷冻保存以供测定。

测定时，准确称取样品2 g(精确至0.000 g)至25 mL塑料离心管中，加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液和10 mL缓冲溶液(pH 5)，加盖振荡器上摇匀1 min。将其置于60 ℃水浴中振摇1 h。每隔20 min，取出振荡器上摇匀1 min。取出将其使用流水降至室温，加入3～5 g NaCl，剧烈振摇1 min后震荡器上振荡15 min。高速离心机中在10 000 r/min下离心5 min。取上层乙腈液2 mL经0.22 um滤膜过滤后上机。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 液相条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C181.7 μm，2.1 mm×50 mm，流动相:A甲醇，B水溶液(乙酸铵5 mmol/L，甲酸0.05%)。流速:0.25mL/min，进样量:1 μL，柱温:40 ℃，流动相梯度如表1所示。流动相梯度如下：0～1 min 10%A；2～3 min 30%A；5 min 45%A；7 min 50%A；7.5 min 60%A；8.5 min 75%A；9 min 80%A；10.5 min 90%A；11～13 min 10%A。

1.4.2 质谱条件

取甲醛-2,4-二硝基苯腙工作液，稀释至1 mg/mL，过膜后置于质谱蠕动泵进样器上，设置蠕动泵以10 μL/min的速度进样，在正负2种模式下扫描，最后得到其最佳质谱条件。

电离模式:ESI-；毛细管电压:3 kV；干燥气温度:450 ℃；干燥气速:900 L/h；锥孔气流速:150 L/h；雾化压力:0.7 MPa；碰撞气流速:0.15 mL/min。

甲醛-2,4-二硝基苯腙检测条件：

母离子208.94(M-)，定量离子162.9，锥孔电压26V、碎裂电压8 V；定性离子46.0，锥孔电压26 V、碎裂电压12 V。

2 结果与分析

2.1 甲醛-2,4-二硝基苯腙和白菜样品质谱图

甲醛-2,4-二硝基苯腙多反应监测质谱图如图1所示，白菜样品的扫描图如图2所示。

图1 甲醛-2,4-二硝基苯腙多反应监测质谱图Fig.1 MRM chromatogram of formaldehyde- 2,4-dinitrobenzhydrazone

图2 白菜样品多反应监测质谱图Fig.2 MRM chromatogram of Chinese cabbage

2.2 线性范围、标准曲线、检出限与定量限

分别取甲醛工作液0.1、0.3、0.6、0.9、1.8 mL至25 mL塑料离心管中，补加缓冲液至10 mL，再加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，混匀后同1.3处理。

甲醛添加量为1～18 μg时，以峰面积为横轴，以甲醛添加量为纵坐标作图，线性回归方程y=0.000 19x+2.451 26，相关系数为0.994。

当甲醛添加量为1 μg时，经衍生化后上机，在出峰时间旁选择一段0.1 min的相对平稳的基线为噪音，计算此时信噪比为，以信噪比为3时的甲醛添加量为方法检出限，信噪比为10时的甲醛添加量为方法定量限，则该方法的检出限为3.06 μg/kg，定量限为10 μg/kg。

2.3 质控回收与白菜中添加回收率与精密度

2.3.1 两种浓度的甲醛标准溶液的质控回收

分别添加2种甲醛质控标准溶液0.1 mL，即甲醛质控添加量分别为6.71、8.09 μg，按照1.3分别进行各6次平行测定，使用6 μg甲醛工作液进行定量，结果如表1所示。

表1 两种浓度的甲醛加标回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of two spiked formaldehyde (n=6)

2.3.2 白菜中添加回收率与精密度

准确称取空白样品2 g(精确至0.001g)至25 mL塑料离心管中，分3组6次平行分别加入甲醛工作溶液0.1、0.2、1 mL，补加缓冲液至10 mL，再加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，混匀后同1.3处理。参照农残的定量的方法，以白菜基质标样(将吹至近干的空白基质中加入某浓度的标准品定容，则为该浓度的基质标样)为标准测定回收率。

3种浓度的添加回收率结果见表2，由表2结果可知，当甲醛添加量为0.5～5 mg/kg时，3种浓度6次平行添加回收率在102%～105%，相对标准偏差为3%～8%，回收稳定，精密度良好，符合GB 27404—2008 “检测方法确认的技术要求”中的规定[18]。

表2 白菜中3种浓度的甲醛加标回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of three spiked formaldehyde in chinese Cabbage(n=6)

3 结论

本文使用2,4-二硝基苯肼衍生法对白菜中甲醛进行衍生化反应，再使用乙腈提取衍生物后经液相色谱串联质谱对其浓度进行检测。该方法甲醛的检出限为3.06 μg/kg，当甲醛含量为1～18 mg/kg，方法线性良好(r2=0.994)。白菜中3种浓度(0.5、1、5 mg/kg)甲醛添加进行6次平行回收实验结果表明，3种浓度添加回收率为102%～105%，相对标准偏差为3%～8%，回收稳定，精密度良好，符合方法要求。

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DeterminationofformaldehydeinChinesecabbagebyhighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry

GU Ya-ping1,QIAO Fang2*,FANG Chang-fa2,HU Xiang-na1,WANG Rui1,LIN Hui-chun1,ZHANG Shi-rui1,YU Shao-zhou1,ZHANG Xiao-qiang1

1(Shenzhen Centre of Inspection and Testing for Agricultural Products,Shenzhen 518040,China) 2(School of Applied Chemistry and Biological Technology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055,China)

In this paper,formaldehyde-2,4-dinitrophenylhydrazone in Chinese cabbage was produced by formaldehyde through 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives methods.Liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis results showed that the detection limit of formaldehyde in this method was 3.06 μg/kg.When the spiking amount in Chinese cabbage was 1-18mg/Kg,the formaldehyde amount was linearly correlated to peak area (r2=0.994).When the amount of formaldehyde was 0.5,1,5 mg/kg,recoveries were between 102% to 105%,and the relative standard deviations were between 3% and 8% with good stability and precision.

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MSMS); Chinese cabbage; formaldehyde; 2,4-dinitrophenylhydrazine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014659

硕士，工程师(乔方为通讯作者，E-mail：szqiaofang@126.com)。

现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-33-20)

2017-05-02，改回日期：2017-06-05