超高效合相色谱法测定火龙果果酒中游离氨基酸的含量

齐宁利，龚霄，马丽娜，张苏慧，龙倩倩，李积华, 2

1(中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工质量安全风险评估实验室，广东 湛江，524001) 2(中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东 湛江,524001)3(华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉，430070) 4(铜仁市食品药品检验所，贵州 铜仁，554300)

超高效合相色谱法测定火龙果果酒中游离氨基酸的含量

齐宁利1，龚霄2*，马丽娜2, 3，张苏慧2, 3，龙倩倩2, 4，李积华1, 2

1(中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工质量安全风险评估实验室，广东 湛江，524001) 2(中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东 湛江,524001)3(华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉，430070) 4(铜仁市食品药品检验所，贵州 铜仁，554300)

建立超高效合相色谱测定食品中游离氨基酸的方法。选取Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱，流动相由A(超临界二氧化碳)和B(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)组成，2.5 mmol/L乙酸铵作为改性剂，流速2.0 mL/min，紫外检测器波长280 nm，补偿范围330～430 nm，背压1 800 psi。结果表明，该方法具有良好的线性(R2= 0.999 0～0.999 8)，分离度高于1.22，检出限和定量限范围分别为23～57 ng/L和70～178 ng/L，线性范围为20～400 μg/mL，加标回收率在85.6%～101.2%之间。该方法被成功用于火龙果酒样品中游离氨基酸含量的测定，也为分析其他食品基质中游离氨基酸分布情况提供了新的方法。

超高效合相色谱(UPC2)；游离氨基酸；测定；火龙果果酒

氨基酸是一类既含氨基(—NH2)又含羧基(—COOH)的有机化合物的统称，是构成生物体蛋白质的基本单位，也是人体必需的营养物质之一，不仅具有营养保健价值，还具有特殊的生理功效。除了作为重要的营养强化剂外，氨基酸本身也呈现酸、甜、苦、鲜味，被广泛用于调味、增香、除臭、保鲜等诸多方面[1-3]。几乎每类食品都含有游离氨基酸，在食品加工过程中，可以与肽、核苷酸、有机酸、糖、无机离子等形成相应的呈味活性物质，赋予每种食物独特的风味特征[4-6]。

目前，食品中游离氨基酸含量的测定主要采用电位滴定法、茚三酮比色法、消旋光法、氨基酸分析仪法、电喷雾质谱法、色谱法等[7-10]。其中，高效液相色谱法准确度最高，应用最广，但该方法最主要的缺点是分析时间长、分离度差、有机溶剂用量大。超高效合相色谱(UPC2)在2012年由Waters公司实现了商业化生产，它集成了超临界流体色谱(SFC)和UPLC技术，以超临界CO2为主要的流动相，不仅可以与极性/非极性的多种固定相联用，还可以使用相同的质谱兼容的助溶剂，结合各种色谱柱进行溶剂梯度调控，影响色谱分离，尤其适合结构类似物，同分异构体，对映异构体和非对映体混合物的分离。具有黏度低、传质性能好、分离效率高、运行时间缩短、绿色环保的优势，对于确证复杂食品基质中的分析物非常有价值[11-14]。本实验建立了超高效合相色谱同时测定火龙果果酒中多种游离氨基酸的方法，并对其系统适用性进行了初步考察，以期为氨基酸代谢组学研究提供新途径和新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火龙果果酒(乙醇体积分数为12%)由湛江中热科技有限公司提供。

氨基酸单标(140624-201506，纯度≥98%)，中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈(色谱纯)、乙酸铵(色谱纯，≥99%)，美国Sigma公司；乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)、标准硼酸盐缓冲液，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；高纯二氧化碳气体(≥99.99%)，湛江氧气厂。

1.2 仪器与设备

超高效合相色谱仪(配有紫外检测器),美国Waters公司；Milli-Q超纯水制备系统,美国默克密理博公司；冷冻离心机，UNIVERSAL公司；旋涡振荡器，德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

分别精确称取0.1 g 各氨基酸标准品，用0.1 mol/L的HCl溶液准确定容至100 mL，配制成1.0 mg/L的标准储备液，通过梯度稀释制备质量浓度为0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/L的系列标准工作液，4 ℃冷藏备用。

1.3.2 样品前处理

取果酒样品10 mL，1 500×g室温下离心5 min，取上清液用0.22 μm水相膜过滤，待衍生化处理。

1.3.3 衍生化方法

参考REDRUELLO等报道的方法[15]，并做了修改。吸取490 μL标准硼酸盐缓冲液(pH 9.0±0.1)于具塞离心管中，依次加入340 μL无水甲醇、450 μL标品或样品、15 μL的DEEMM，旋涡振荡30 s后超声水浴处理30 min，然后转移到80 ℃水浴中恒温反应2 h，以保证过量的衍生化试剂和副产物完全降解，待反应体系冷却至室温后加入等体积甲醇，用0.22 μm水相膜过滤后进样分析。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相A为CO2，B为添加2.5 mmol/L乙酸铵的甲醇和乙腈(1∶1，v/v)混合溶液；流速1.0 mL/min；进样量2.0 μL；柱温40 ℃；检测波长280 nm，补偿范围330～430 nm；背压1 800 psi；梯度洗脱：0～0.2 min 98% A，0.2～5.0 min 98%～70% A，5.0～15.0 min 70% A，15.0～17.5 min 70%～98% A。

1.3.5 系统适用性实验

按照徐莉等[16]的方法进行线性、检测限和定量限、灵敏度和精密度、回收率等系统适用性考察。

2 结果与分析

2.1 色谱柱筛选

色谱的分离效果很大程度上取决于色谱填料及其键合方式[12]。本实验选择Acquity UPC2BEH (3.0 mm×100 mm，1.7 μm)、HSS C18SB(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)和Torus PIC(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)四款UPC2色谱柱，以选择性、分离度为主要指标进行筛查，结果见图1。

图1 不同色谱柱分离氨基酸混标衍生物的色谱图Fig.1 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different chromatography columns

色谱柱Acquity UPC2Torus Diol填料为高密度二醇，其表面键合相的色谱性能与传统的未键合硅胶固定相相当，可以有效改善酸性或碱性化合物分离过程中的整体稳定性。由图1可知，Torus Diol色谱柱能够将多数氨基酸衍生物有效分离，具有较好选择性。

2.2 改性剂的选择

氨基酸是一类含有碱性氨基和酸性羧基的有机物，在水溶液中通常以兼性离子或偶极离子的形式存在，表现出典型的两性电解质特征。改变流动相pH环境会影响氨基酸衍生物的电离特性，进而有助于改善峰形[16]。

本实验选择三氟乙酸或乙酸铵作为改性剂，以考察改性剂对氨基酸衍生物峰形的影响。结果发现乙酸铵对氨基酸衍生物的拖尾峰形有较好的改善，图2分别为添加改性剂前后氨基酸标品衍生物的色谱图。鉴于乙酸铵本身是一种强电解质盐，容易对超临界系统造成影响，轻则损伤色谱柱、降低柱效，重则堵塞系统管路、引起压力激烈波动，故将2.5 mmol/L的乙酸铵作为改性剂。

图2 添加改性剂分离氨基酸标品衍生物的色谱图Fig.2 Chromatograms of amino acid derivatives separated with or without mobile phase modifier

2.3 助溶剂选择

超临界流体色谱是以超临界CO2为主体，以少量甲醇、乙腈或异丙醇等有机溶剂为助溶剂，通过调整流动相的极性改变对分析物的溶解性，进而达到改变目标物洗脱顺序和优化分离效果的目的[17]。本实验比较了甲醇、乙腈、甲醇和乙腈混合溶液等作为助溶剂对氨基酸衍生物的分离效果。

由图3可以看出，在助溶剂甲醇中加入等体积乙腈，极性相对降低，流动相的溶解能力也得到相应改变，部分氨基酸衍生物的保留变弱，出峰时间推迟，使得部分氨基酸衍生物之间的分离效果提高。虽然超临界流体系统中采用的助溶剂比例不高，但对目标化合物的保留强度即出峰时间快慢有着重要影响，这对于超临界流体色谱方法开发、色谱条件优化具有非常重要的意义。

图3 不同助溶剂分离的氨基酸衍生物标品的色谱图Fig.3 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different co-solvents

2.4 其他色谱条件优化

超高效合相色谱技术结合了亚2 μm填料和高效超临界流色谱两项技术的优点，具有较高的扩散系数和传质速率，分析时间更短，分离效能更高。由于温度、压力和流速的微小变化都能引起流动相密度改变，进而改变对分析物的溶解能力，所以调节柱温、自动调节备压都可以调节目标化合物的分离效果[16-17]。本实验考察了自动调节背压(1 500～2 200 psi)、柱温(30～60 ℃)和流速(1.0～3.0 mL/min)对样品中目标峰峰形及分离效果、色谱柱压力及系统压力、分析时间的影响。为保证系统安全，尽可能实现不同种类氨基酸衍生物及其与样品杂质的良好分离，优化后色谱条件为：背压1 800 psi，柱温50 ℃，流速2.0 mL/min，结果见图3。需要强调的是，与色谱柱、助溶剂及改性剂相比，这些色谱条件对目标物分离不起关键作用，且它们之间相互影响，在实际方法开发过程中应予以考虑。

2.5 线性、检测限和定量限、灵敏度和精密度、回收率

选取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的氨基酸标准溶液，按照1.2.3方法进行衍生化，考察线性、检测限和定量限、灵敏度和精密度、回收率等指标[18-19]。在上述优化后的色谱条件下进行测定，根据氨基酸单标衍生物的保留时间进行定性(如图4A所示)。以氨基酸衍生物质量浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，线性范围在20～400 μg/mL；根据信噪比(S/N=9)计算出氨基酸的检出限在23～57 ng/L，定量限在70～178 ng/L；通过加标(添加水平分别为0.5、0.2、0.05 mg/mL)回收实验得到加标回收率在85.6%～101.2%之间，相对标准偏差0.48%～1.36%，结果见表1。由表1可知，该方法分离效果好(R=1.22～21.38)、灵敏度和精密度高，准确性和再现性好。

1-亮氨酸；2-异亮氨酸；3-缬氨酸；4-丙氨酸；5-蛋氨酸；6-甘氨酸；7-苯丙氨酸;8-脯氨酸;9-丝氨酸; 10-酪氨酸;11-谷氨酸;12- 组氨酸;13-天冬氨酸;14-赖氨酸;15-精氨酸;16-半胱氨酸)图4 氨基酸标品(A)和样品(B)中氨基酸衍生物的色谱图Fig.4 Chromatogram of the derivatives of standard amino acids (A) and selected sample (B)

表1 氨基酸的线性、灵敏度、精密度及回收率Table 1 Linear ranges,sensitivity,precision and recovery of standard amino acids

注：x，氨基酸的质量浓度(μg/mL)；y，氨基酸积分峰面积；1)检出限(ng/L)：信噪比(S/N)为3；2)定量限(ng/L)：信噪比(S/N)为10。

2.6 样品分析

取红心火龙果酒1 mL，按照1.2.3方法进行衍生化，用0.22 μm水相膜过滤，利用优化后的色谱条件进样测定，色谱图如图4B所示。

火龙果酒中游离氨基酸含量见表2。由表2可知，火龙果酒中的主要氨基酸有组氨酸(12.17 mg/L)、酪氨酸(5.02 mg/L)、丝氨酸(4.37 mg/L)、蛋氨酸(3.85 mg/L)、甘氨酸(3.76 mg/L)、苯丙氨酸(3.28 mg/L)和丙氨酸(3.22 mg/L)；其次为异亮氨酸(2.46 mg/L)、精氨酸(2.37 mg/L)、亮氨酸(2.03 mg/L)；此外，还有少量的赖氨酸(1.72 mg/L)，脯氨酸(1.53 mg/L)。

表2 火龙果酒样品中游离氨基酸含量 单位：mg/LTable 2 Content of free amino acids of the selected pitaya wine

3 讨论与结论

超高效合相色谱主要以超临界CO2为主，具有黏度低、传质性能高和分离效率好等优点。同时，助溶剂使用量大大降低，降低了运行成本并减少了对环境的污染。结合色谱柱亚 2 μm颗粒填料技术，使其在手性化合物、同分异构体、结构类似物等分析中具有明显优势，被公认为是一种高效液相色谱和气相色谱的补充技术或替代技术。

前期对几种不同试剂的衍生效果进行了比较实验，最终选择操作过程简单、衍生化产物稳定的DEEME作为氨基酸柱前衍生化试剂[20-23]，建立了基于超临界流体色谱法测定食品中多种游离氨基酸的方法，结果表明该方法具有分析时间短、准确性高、重现性好等优点。本实验虽然针对火龙果果酒样品进行了方法验证，理论上对于固体及半固体食品同样适用，只要对样品增加必要的预处理步骤，然后采用0.1 mol/L的HCl溶液进行均质，离心取上清液即可。针对游离氨基酸含量较高的食品基质需要进行适当稀释，必要时，也要对方法的洗脱程序进一步优化，以使目标峰和杂质峰得到有效分离。当然，进一步开展与HPLC色谱法的对比实验也是今后研究的重要内容[24]。总之，超高效合相色谱法对分析火龙果果酒中游离氨基酸种类及含量具有重要意义[25]，也为开展传统发酵食品加工过程中氨基酸代谢组学研究提供了新途径和新方法。

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Determinationoffreeaminoacidsinpitayawinebyultraperformanceconvergencechromatography

QI Ning-li1,GONG Xiao2*,MA Li-na2,3,ZHANG Su-hui2,3,LONG Qian-qian2,4,LI Ji-hua1,2

1(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment on Agro-products Processing,Ministry of Agriculture,Zhanjiang 524001,China) 2(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001,China) 3(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) 4(Tongren Institute for Food and Drug Control,Tongren 554300,China)

A new method based on ultra performance convergence chromatography (UPC2) was developed for analysis of free amino acids in fruit wine.They were separated on an Acquity UPC2Torus Diol (3.0 mm×100 mm,1.7 μm) with a mobile phase consisted of supercritical CO2and methanol ∶acetonitrile (1∶1v/v,with 2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase modifier).The flow rate was 2.0 mL/min and DAD detection was set at 280 nm with a compensation range of 330-430 nm.Back pressure was 1 800 psi.The results showed good linearity (R2=0.999 0-0.999 8) and high resolution (>1.22).The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) ranged from 23-57 ng/L and 70-178 ng/L,respectively.The linear range was between 20 and 400 μg/mL.The spiked recoveries were ranged from 85.6% to 101.12%.It was applied for the free amino acids analysis of selected pitaya wine,which could also provide a new method for the analysis of free amino acid distribution in other food matrix from different sources.

ultra performance convergence chromatography (UPC2); free amino acids; determination; pitaya wine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015034

讲师(龚霄副教授为通讯作者，E-mail:yiyesuifeng@126.com)。

中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630122017021);湛江市科技计划项目(2016A03012);农业部公益性行业(农业)科研专项(201303077)

2017-06-26，改回日期：2017-08-30