猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊治分析

卢建洲，蒋增海，邓同炜，霍元楠，王宇坤

（1．河南牧业经济学院，动物医学院，河南 郑州 450046；2．河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊治分析

卢建洲，蒋增海*，邓同炜，霍元楠，王宇坤

（1．河南牧业经济学院，动物医学院，河南 郑州 450046；2．河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

猪链球菌病是由多种不同血清群（C、D、E、L群）的链球菌引起的不同临诊传染病的总称，临床上主要是以淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎以及败血症为主要特征，其中，猪链球菌是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，该菌可引起猪脑膜炎和败血症等症状，并能通过黏膜或者伤口等传播途径感染人[1]。猪是多杀性巴氏杆菌的易感动物之一，猪群中流行的多杀性巴氏杆菌血清型多为A型和D型，主要引发猪肺疫和猪进行性萎缩性鼻炎[2]。近年来，猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染病例报道较少[3-4]。2017年2月下旬，河南濮阳某800头基础母猪规模化场，保育后期、育肥前期的猪群陆续发病，送来我单位诊断，笔者通过临床综合诊断和实验室诊断，确诊为猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染，现将报道如下。

1 临床症状

该猪场存栏保育后期、育肥前期的猪群约1 500余头，50～120日龄，从2月上旬，相继陆续发病，表现为精神沉郁，食欲减退，体温升高为41～42 ℃，眼结膜潮红，腹式呼吸，喘气，四肢无力，趴卧地面，耳廓、腹部、四肢皮肤有紫红色出血斑块（图1）；有的猪晚上发病、早上死亡，口鼻流出血样泡沫；有的关节肿大、跛行；有的保育仔猪头颈歪斜，共济失调，走路摇晃，病程长的保育仔猪严重消瘦。整个猪场自发病以后，发病率约为40%，死亡率约为15%，使用氟苯尼考、替米考星、强力霉素等，疗效不明显。

2 剖解病理变化

腹股沟淋巴结肿大（图1），颌下淋巴结肿大；心包积液（图2），心包液内有少量的纤维性物质；有的猪心外膜有大量纤维素物质包裹，呈绒毛心；气管内有大量出血泡沫液体；肺脏出血，呈紫红色，有肉变区，有的猪肺气肿，切面流出泡沫样液体；有的猪肾脏针尖状出血点；关节积液增多，内有纤维絮状物。

3 实验室诊断

3.1 主要试剂

TSA（胰蛋白大豆琼脂）、TSB（胰蛋白大豆肉汤）购自美国BD（Becton，Dickinson and Company） 公司；TSA平板、TSB肉汤配制时，分别添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）终浓度为10 mg/L和犊牛血清（终浓度50 mL/L)；2×Taq PCR MasterMix/with dye购自加拿大ABM公司；Marker 2000等购自宝生物工程（大连)有限公司；药敏片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

3.2 引物与合成

猪链球菌特异性扩增引物，参照文 献[5]，P1 ：GCAGCGTATTCTGTCAAACG，P2：CCATGGACAGATAAAGATGG，预期扩增片段大小为689 bp；多杀性巴氏杆菌特异性扩增引物，参照文献[6]，P1：5′ -ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，P2：5 ′ -GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′，预期扩增片段大小为457 bp，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.3 分离、培养

无菌采集患猪肺脏，引火自燃消毒肺脏表明，使用灭菌剪刀与镊子，剪去肺脏表面，采集深部肺脏组织，涂抹于TSA平板（添加有NAD，犊牛血清），37 ℃培养24～48 h，生长出一种白色、半透明、圆形菌落，约为0.5～1 mm；另外一种淡浅色、圆形、湿润菌落，大小约为1～1.5 mm，进一步将两株菌落接种于TSA平板（添加有NAD，犊牛血清）纯化、传代。

3.4 染色、镜检

无菌采集病变部位的肺脏组织，染色后，观察到疑似两种细菌，一种为革兰氏阳性、单个或短链球菌，另外一种为革兰氏阴性短杆菌或个别稍长杆菌（图3）。将分离、纯化的可疑菌，染色、镜检，观察到一种为革兰氏阳性、链状排列的球菌，疑似猪链球菌（图4）；另外一种为革兰氏阴性、卵圆性的短小杆菌，疑似为多杀性巴氏杆菌（图5）。

3.5 PCR鉴定

根据参考文献[5-6]，利用PCR方法，扩增疑似为猪链球菌、多杀性巴氏杆菌的特异性片段，结果显示扩增出猪链球菌689 bp 特异性片段、多杀性巴氏杆菌457 bp片段，与预期一致（图6），表明分离两种细菌为猪链球菌和多杀性巴氏杆菌。

3.6 药敏试验

选择18种药物，采用纸片扩散法，测定分离的猪链球菌和多杀性巴氏杆菌药物敏感性，其结果见表1。结果表明猪链球菌和多杀性巴氏杆菌对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、环丙杀沙星菌等敏感，因此，建议该养殖户，针对发病严重猪只，使用氨苄西林、青霉素、或者恩诺沙星单独，或者联合注射治疗，同时使用阿莫西林拌料，适当加大用药剂量，连用5～7 d。治疗效果明显，1周后，该猪场疫情平息。

图1 腹部皮肤出血和腹股沟淋巴结出血

图2 心包积液

图3 肺膈叶病料中疑似链球菌、巴氏杆菌（革兰氏染色）

图4 分离链球菌（革兰氏染色）

图5 分离多杀性巴氏杆菌（革兰氏染色）

图6 分离细菌PCR鉴定结果

表1 分离猪链球菌、多杀性巴氏杆菌对各种药物的抑菌圈

4 分析与讨论

通过临床症状与病变，容易诊断为急性传染性胸膜肺炎，因此笔者采用TSA平板（加有NAD、犊牛血清）分离发病猪群感染的病原，是为了判断能否分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌，及副猪嗜血杆菌（该培养基，能够适合这两种菌的生长）。实验结果显示分离到的两种细菌分别为猪链球菌和多杀性巴氏杆菌，结合临床症状和病理变化，最终确诊为猪链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染，混合感染时，病情更加复杂，增加诊断难度，必须依靠实验室检测才能确诊。

根据养殖户反映，使用氟苯尼考、替米考星、强力霉素等药物，疗效不佳，笔者推测猪群感染耐药性菌株所致。因此，分离猪链球菌和多杀性巴氏杆菌，进行药物敏感试验，结果显示，氨苄西林、阿莫西林、青霉素、恩诺沙星、环丙沙星等药物敏感，最后，根据药敏试验结果，使用氨苄西林、青霉素、或者恩诺沙星联合注射治疗，阿莫西林拌料给药，适当加大剂量，疗效明显。兽医临床中，由于滥用药物，耐药性问题相当严重，分离病原菌、进行药敏试验，对于正确指导用药十分重要。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].6版.北京：中国农业出版社， 2015：156-157.

[2] 彭忠， 王庚， 吴广敬， 等. 猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J]. 中国兽医科学 ， 2015， 45(9)： 943-951.

[3] 吴柯青. 猪链球菌病与猪多杀性巴氏杆菌病混合感染的诊治[J]. 福建畜牧兽医 ， 2010， 32(6)： 73.

[4] 娄欣建. 一例母猪猪肺疫与链球菌病混合感染的诊治[J]. 养殖技术顾问，2012(3)： 186.

[5] OKUMABUA O，O’ CONNOR M，SHULL E. A polymerase chain reaction(PCR)assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J].FEMS Microbiol Lett，2003，218(1)：79-84.

[6] 唐先春， 吴斌， 陈焕春. 猪多杀性巴氏杆菌 PCR 检测方法的建立及其应用[J]. 中国兽医科技 ，2004， 34(2)： 46-48.

河南牧业经济学院预防兽医学重点学科建设项目（项目编号：MXK2016102）；

卢建洲（1963-），男，河南巩义人，主要从事猪病临床诊断与防治研究；

*通讯作者：蒋增海（1976-），男，四川简阳人，讲师，在职博士，主要从事猪病原微生物研究。E-mail：50242328@qq.com。

2017-09-20)