葶苈生脉方对充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信号通路的干预效应*

河北医科大学第二医院

田小超 郭秋红△ 孙冠婴△ 何伟亮 张 凯△(石家庄 050000)

实验研究

葶苈生脉方对充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信号通路的干预效应*

河北医科大学第二医院

田小超郭秋红△孙冠婴△何伟亮张凯△(石家庄050000)

目的：研究葶苈生脉方对充血性心力衰竭(CHF)大鼠左心室肌RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达的影响，探讨其防治心肌重塑的作用机制。方法：将健康雄性SD大鼠随机分为5组，假手术组、模型组、葶苈生脉方低剂量组、高剂量组和对照组。除假手术组只分离腹主动脉不结扎外，其余4组采用腹主动脉缩窄法制作CHF大鼠模型。5组均于手术后4周开始灌胃、腹腔注射给药(水)，连续8周。停药(水)24 h后迅速股动脉取血及左心室组织剥离，采用放射免疫分析法检测血浆AngⅡ含量，Western Blotting技术测定RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白的表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠血浆AngⅡ含量，心肌组织RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达均明显增高(P<0.01)。与模型组比较，各给药组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达均显著降低(P<0.01)，葶苈生脉方低剂量组、高剂量组大鼠血浆AngⅡ含量降低(P<0.01)。结论：葶苈生脉方通过调节RhoA/ROCK信号通路，降低RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达，改善心肌重塑，从而有效缓解大鼠CHF。

充血性心力衰竭；葶苈生脉方；邢月朋；心气虚；益气温阳；活血利水；RhoA/ROCK信号通路

充血性心力衰竭(CHF)是多种心脏疾病引起心肌结构和功能改变的最终转归，具有较高的发病率及死亡率。葶苈生脉方为全国名老中医邢月朋根据多年临床经验总结出的治疗气虚血瘀、阳虚水停型CHF的经验方，经过临床验证能有效缓解患者症状，改善生活质量，减少住院时间。在笔者以往的研究中发现，葶苈生脉方能改善压力超负荷大鼠血流动力学各项指标，降低心肌细胞凋亡率，减轻心肌纤维化，有效防止心室重塑。[1-2]此研究拟通过观察葶苈生脉方对RhoA/ROCK信号通路的干预效应，进一步探讨其防治心室重塑的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体质量170～200 g，购于河北医科大学实验动物中心。

1.2 药品与试剂 葶苈生脉方由葶苈子、红参、麦冬、五味子、桂枝、茯苓、川芎等药物组成，实验时分别配制成所需浓度的水煎液；盐酸法舒地尔注射液购自天津红日药业股份有限公司；Ang II放免分析药盒购自北京解放军总医院放免所； RhoA一抗、ROCK1一抗、p-MYPT-1一抗均购自英国Abcam公司，c-fos一抗购自美国Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 CHF大鼠模型制备： 参考Anversea方法，[3]将60只大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉，于剑突下沿腹正中线逐层开腹，在双肾动脉上方0.5 cm处分离腹主动脉，除假手术组10只大鼠只分离腹主动脉，不结扎外，其余50只沿腹主动脉平行放置一直径0.7 mm 7号一次性注射器针头，用0号手术丝线将腹主动脉和针头结扎在一起，然后抽出针头，使腹主动脉缩窄60%～70%。术后抗生素处理，观察4周。

1.3.2 实验动物分组及标本制备： 除假手术组外，将行腹主动脉缩窄术4周后存活大鼠40只随机分为4组，每组10只：即模型组、葶苈生脉方高、低剂量组、对照组。假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃，生理盐水腹腔注射；葶苈生脉方组灌胃给药(低剂量15 g/kg，高剂量30 g/kg)，生理盐水腹腔注射；对照组腹腔注射法舒地尔10 mg/kg，蒸馏水灌胃。各组每次灌胃量按1 mL/100 g计算，腹腔注射量按5 mL/kg计算，每日1次，共给药8周。末次给药24 h后，用20%乌拉坦(6.5 mg/kg)腹腔注射麻醉。股动脉取血后迅速开胸摘取心脏，切取左心室用锡箔分装，置于液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中备用。

1.3.3 放射免疫分析法检测血浆AngⅡ含量：将股动脉血置于肝素、EDTA抗凝试管中，4℃ 2 500 r/min分离血浆，采用放射免疫分析法，严格按试剂盒说明书检测。

1.3.4 Western blotting 检测RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达：常规提取蛋白，考马斯亮蓝G-250染色法进行蛋白定量。经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为50 μg总蛋白)，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗抗体RhoA(1∶1 500)，ROCK1(1∶500)，p-MYPT-1(1∶500)，c-fos(1∶500)4℃过夜。去一抗，PBST冲洗4次，加入辣根过氧化酶标记的IgG二抗，室温孵育2 h，洗膜，加入ECL试剂显影定影。应用凝胶图像处理系统进行目标条带的灰度分析，以β-actin为内参，所得比值表示目标蛋白相对含量。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆AngⅡ含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠血浆AngⅡ含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，葶苈生脉方高、低剂量组血浆AngⅡ含量显著降低(P<0.01)，对照组含量降低，但差异无显著性；葶苈生脉方高、低剂量组血浆AngⅡ含量低于对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血浆AngⅡ含量比较

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与对照组比较，△P<0.05

2.2 各组大鼠左室心肌组织RhoA、ROCK1蛋白表达相对含量比较 与假手术组比较，模型组RhoA、ROCK1蛋白表达量升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组RhoA、ROCK1蛋白表达量下降(P<0.01)；对照组ROCK1蛋白表达量低于葶苈生脉方高、低剂量组(P<0.05)。详见表2。

组别nRhoAROCK1假手术组100.221±0.0470.098±0.021模型组100.612±0.093*0.401±0.069*低剂量组100.378±0.075#0.267±0.055#△高剂量组100.351±0.050#0.258±0.050#△对照组100.422±0.071#0.195±0.066#

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与对照组比较，△P<0.05

2.3 各组大鼠左室心肌组织p-MYPT-1、c-fos蛋白表达相对含量比较 与假手术组比较，模型组p-MYPT-1、c-fos蛋白表达量升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组p-MYPT-1、c-fos蛋白表达量下降(P<0.01)。各给药组之间比较，差异无显著性(P>0.05)。详见表3。

组别np-MYPT-1c-fos假手术组100.372±0.0670.332±0.050模型组100.821±0.101*0.720±0.089*低剂量组100.523±0.098#0.467±0.067#高剂量组100.497±0.071#0.442±0.053#对照组100.472±0.082#0.501±0.073#

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3 讨论

心室重塑包括左室壁细胞结构成分和细胞外基质成分的改变，是导致心功能逐渐恶化的关键因素。众多研究表明低分子量GTP酶RhoA以及其下游效应因子Rho激酶(ROCK1)通路介导的各种细胞功能参与了心肌重塑的发生发展各个阶段。[4]刺激因子AngⅡ等通过与 Gq偶联，增加RhoA的表达及向细胞膜的移位，表明RhoA蛋白是心脏肾素-血管紧张素系统( RAS)激活的下游靶点。[5]随着CHF时RAS系统的激活，大鼠心肌RhoA表达逐渐增高, 伴随发病时间延长, 心肌重塑增加, 心力衰竭加重，其增高就越明显。因此RhoA 过度增加是促进CHF发生、发展的病理生理机制之一，RhoA/ROCK信号转导通路将成为CHF的一个很有前景的新的治疗干预靶点。研究证实，使用ROCK抑制剂可改善AngⅡ、压力超负荷大鼠等所引起的心肌肥厚，[6]法舒地尔是目前临床上唯一应用的ROCK抑制剂，通过特异性抑制ROCK能降低心肌纤维化和心肌细胞凋亡，从而改善心肌重构。[7]

众多研究表明，原癌基因c-fos、c-jun、c-myc等参与了心肌重构过程中的心肌纤维化、左心室肥厚，c-fos 基因作为一个通用转录因子，与各种细胞外信号通过多条信号转导途径引起细胞应答导致心肌重构有关。有研究显示心力衰竭大鼠心肌组织原癌基因c-fos表达增加，抑制ROCK能够降低c-fos的表达，同时在心肌细胞激活RhoA可引起c-fos基因表达上调，[8]表明原癌基因c-fos参与RhoA/ROCK信号通路诱导心肌损伤。

全国名老中医邢月朋根据多年临床经验，认为CHF的病机首推心气虚，心气虚为始发之根本，气虚易及阳，导致阳气亏虚，在此基础上又继发瘀血、水饮等病理产物。《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》亦指出虚、瘀、水是CHF的核心病机。[9]葶苈生脉方由红参、黄芪、麦冬、五味子、葶苈子、桂枝、茯苓、白术、猪苓、泽泻、丹参、红花、川芎组成，具有益气温阳，活血利水之效。葶苈生脉方能抑制CHF大鼠RAS系统的过度激活，调控心肌组织CVF和TGF-β1的表达，减轻心肌纤维化，逆转心室重塑，呈现出多途径、多靶点的治疗作用。[1-2]

本研究与以往结果相同，葶苈生脉方可有效降低压力超负荷大鼠血浆AngⅡ含量。同时研究还表明葶苈生脉方和法舒地尔均可下调CHF大鼠心肌组织RhoA、ROCK1蛋白表达，在抑制ROCK1蛋白表达方面法舒地尔干预效应强于葶苈生脉方。Rho激酶对肌球蛋白轻链磷酸酯酶的调节主要是通过磷酸化MYPT-1来完成，两药均可降低RhoA/ROCK信号通道的重要下游通道MYPT-1磷酸化水平，以降低ROCK的活化程度。在本次实验中，压力超负荷大鼠心肌组织c-fos蛋白表达上调，用法舒地尔干预治疗后，c-fos蛋白表达下降，表明法舒地尔抗心肌肥大与其抑制c-fos蛋白表达有关，葶苈生脉方亦能有效降低c-fos蛋白表达。综上所述，葶苈生脉方对RhoA/ROCK信号通路的抑制可能是其逆转心室重塑，防治CHF的作用机制之一。

[1] 翟卷平，郭秋红，王卓，等. 葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响[J]. 河北中医药学报，2010，25(2)：5-6

[2] 郭秋红，刘敬坡，赵淑明，等. 葶苈生脉方对心衰大鼠RAAS及心肌组织AT-1mRNA表达的影响[J]. 中华中医药杂志，2010，25(10)：1 654-1 656

[3] Anversea P，Hagopian M，Alder V. Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy[J]. Lab Invest，1973,29(3):282

[4] Kobayashi N，Takeshima H，Fukushima H，et al. Cardioprotective effects of pitavastatin on cardiac performance and remodeling in failing rathearts[J]. Am J Hypertens，2009，22 ( 2) : 176-182

[5] Morissette MR, Sah VP, Glembotski CC, et al. The Rho effector, PKN, regulates ANF gene transcription in cardiomyocytes through a serum response element[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278(6):H 1 769-1 774

[6] Phrommintikul A, Tran L, Kompa A, et al. Effects of a rho kinase inhibitor on pressure overload induced cardiac hypertrophy and associated diastolic dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008, 294(4): 1 804-1 814

[7] Ueyama T, Sakoda T, Kawashima S, et al. Activated Rho A stimulates c-fos gene expression in myocardial cells[J].Circ Res,1997, 81: 672-678

[8] Shimokawa H, Rashid M. Development of Rho-kinase inhibitors for cardiovascular medicine[J]. Trends Pharmacol Sci, 2007, 28(6):296-302

[9] 李金根，徐浩. 慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识：亮点与解读[J]. 中国中西医结合杂志，2016，36(2)：142-145

InterventionEffectsofTingliShengmaiFangonSignalPathwayofMyocardialRhoA/ROCKinRatswithCongestiveHeartFailure

TIANXiao-chaoGUOQiu-hongSUNGuan-yingHEWei-liangZHANGKai(Shijiazhuang 050000)

Second Hospital of Hebei Medical University

Objective: to study the effect ofTingliShengmaiFangon left ventricular muscle RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression in rats with congestive heart failure (CHF), and to investigate its mechanism of prevention and treatment of myocardial remodeling. Methods: Healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups: sham operation group, model group,TingliShengmaiFanglow dose group, high dose group and control group. Except for the dissection of abdominal aorta without ligature in the sham operation group, the abdominal aorta coarctation method was employed to make the CHF rat model of the other 4 groups. The 5 groups were treated with intragastric administration and intraperitoneal injection (water) for 8 weeks at the 4th week after the operation. After withdrawal (water) for 24 h, blood was collected and left ventricular tissue was rapidly removed from femoral artery. Plasma Ang II content was detected by radioimmunoassay. The expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein was detected by Western Blotting. Results: Compared with sham operation group, the level of Ang II and the expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein in myocardial tissue of model group increased significantly (P< 0.01). Compared with the model group, RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression of each administration group were significantly decreased (P< 0.01), plasma Ang II levels ofTingliShengmaiFanglow and high dose groups were reduced (P< 0.01). Conclusion:TingliShengmaiFangcan reduce the expression of p-MYPT-1 and c-fos protein and improve myocardial remodeling through regulating the pathway of RhoA/ROCK, RhoA, ROCK1, thus effectively alleviate the rat CHF.

congestive heart failure;TingliShengmaiFang;XINGYue-peng; heart-qi deficiency; ：YiqiWenyang(benefiting qi and warming yang);HuoxueLishui(activating blood and excreting water); RhoA/ROCK signaling pathway

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0001-03

* 河北省中医药管理局资助项目：No.2016048

△ 河北中医学院(石家庄050200)

张凯，男，硕士，副教授。

(2017-09-23 收稿)