AR与Mda9/syntenin在三阴性乳腺癌中的表达及其意义

黄元坤 周志兵 周蕾蕾

AR与Mda9/syntenin在三阴性乳腺癌中的表达及其意义

黄元坤 周志兵 周蕾蕾

目的探讨研究雄激素受体(AR)与黑色素瘤分化相关基因9/配体蛋白聚糖结合蛋白(Mda9/syntenin)在三阴性乳腺癌中的表达及其意义。方法80例三阴性乳腺癌组织，采用免疫组织化学法对其AR与syntenin的表达情况检测，并探讨二者与临床病理特点的关系，采用 Kaplan-Meier生存曲线评价患者无病生存率，COX比例回归模型进行多变量分析。结果AR阳性表达率为 37.50%，syntenin阳性表达率为98.75%；AR与组织学分级呈负相关性(γs=-0.236，P<0.05)，syntenin与淋巴结转移状态呈正相关性(γs=0.296，P<0.05)，与肿瘤大小呈正相关性(γs=0.370，P<0.05)，与组织学分级也呈现正相关性(γs=0.230，P<0.05)；无病生存者占77.5%(62/80)，AR阴性与AR阳性患者、不同程度AR表达程度与无病生存期(DFS)均无相关性(P>0.05)，而syntenin不同表达程度与DFS存在相关性(P<0.05)；单因素分析显示：淋巴结转移是影响DFS的重要因素(P<0.05)，多因素分析显示淋巴结转移、肿瘤>5 cm均是DFS危险因素(P<0.05)。结论AR与患者的组织学分级相关、syntenin与组织学分级、淋巴结转移情况、肿瘤大小呈正相关性，syntenin表达与DFS存在明显关联。

雄激素受体；黑色素瘤分化相关基因9；配体蛋白聚糖结合蛋白；三阴性乳腺癌；临床病理

近年来乳腺癌发病率逐年升高，已成为恶性肿瘤致女性死亡的主要因素，其高发病率和高死亡率已对女性生活质量造成极大威胁[1]。近年来相关研究证实[2]，雄激素受体(AR)与配体蛋白聚糖结合蛋白(syntenin)蛋白表达和三阴性乳腺癌临床病理特点、临床预后等均存在一定关联，但尚需要深入探究。基于此，本研究特对80例三阴性乳腺癌组织中AR和syntenin表达情况进行检测，观察2种蛋白在不同临床病理特点下表达水平，并分析其临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集自2004年12月至2009年12月四川省人民医院乳腺外科行改良根治术或保乳手术的80例三阴性乳腺癌患者的石蜡包埋组织块及临床资料。纳入标准：①经乳腺外科行乳腺癌改良根治术或保乳手术并经病理及免疫组化证实为三阴性乳腺癌；②病理类型为浸润性导管癌；③术前未行新辅助化疗，且术前未发现远处转移；④石蜡包埋组织块完好，临床资料完整。排除标准：①其它类型原发性恶性肿瘤，乳腺转移者；②合并其它严重内科疾病或系统性疾病者；③存在既往乳房手术史者。所有患者均为女性，年龄31～80岁，平均(52.67±13.32)岁，肿瘤大小：<2 cm 29例、>2 cm且≤5 cm 50例、>5 cm 1例。参照2012年WHO浸润性乳腺癌分级标准[3]，Ⅰ级5例，Ⅱ级31例，Ⅲ级44例。颈淋巴结未转移54例，淋巴结无转移者26例，其中转移淋巴结≤3枚者13例，≥4且≤9枚者有7例，≥10枚者有6例。

1.2 方法

1.2.1 主要实验试剂 AR鼠抗人单克隆抗体(AR441)购于中国上海酶联免疫生物科技有限公司。兔抗多克隆syntenin抗体(ab19903)购于中国深圳晶美生物科技开发有限有限公司。EnVision试剂盒购于DAKO公司。

1.2.2 AR和syntenin表达检测方法 采用免疫组化法对AR和syntenin蛋白表达情况进行检测，具体如下：①使用福尔马林(浓度为10%)液固定，常规切片；②采用Envision免疫组化二步法进行染色：于Poly-Lysine中将待测样本浸泡5 min，取出后烤干待用，以4 μm厚度连续切片，完成后将其置于40 ℃恒温器中，并分别平整粘附于两张载玻片上；将载玻片置于60 ℃烤箱中120 min后取出，并分别置于二甲苯I和Ⅱ中10 min×2，取出后放入梯度酒精中(浓度分别为100%×2次，90%，80%)，4次×5 min；高压修复抗原；③放入过氧化氢溶液(浓度为3%)中室温孵育15 min，分别加入 100～150 μlAR鼠抗人单克隆抗体(一抗)，100～150 μl兔抗多克隆syntenin抗体(稀释浓度为1∶150)，放入4 ℃冰箱中过夜；④PBS缓冲液冲洗3次×5 min，甩干后滴加100～150 μL即用型酶标二抗，室温条件下孵化30 min。PBS缓冲液冲洗3次×5 min，甩干后滴加50～100 μlDAB显色剂，室温孵育并于适度时终止显色；⑤苏木精轻度复染，脱水,透明,封片处理后采用显微镜观察。

1.2.3 结果判读 ①AR染色结果判读：以细胞核内呈现棕褐色颗粒沉积记为AR阳性。阳性对照：已知AR阳性切片，阴性对照：PBS代替一抗。随机选择5个视野(200倍)，计算阳性肿瘤细胞比率，<5%计为0分，5%～25%计为1分，25%～50%记为2分，≥50%记为3分；染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；将阳性细胞比率和染色强度分值总和作为阳性判断标准，其中0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(++)，3～4分为中等阳性(++)，4分以上为强阳性(+++)；②syntenin染色结果判读：以胞质呈棕色为syntenin阳性染色。阳性对照：已知阳性的syntenin；阴性对照：PBS代替一抗。随机选取5个高倍镜视野(200倍)，染色强度(A)：不染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。染色细胞比率(B)：<5%计为0分，5%～25%计为1分，25%～50%记为2分，≥50%记为3分，将A与B相加再除以5作为评分标准。评分大于50分为syntenin阳性，最终评分0～50分为阴性(-)，51～100分为弱阳性(+)，101～200分为中等阳性(++)，201～300分为强阳性(+++)。

1.3 观察指标

观察AR与syntenin在三阴性乳腺癌中的表达情况；分析AR、syntenin与乳腺癌临床病理特点的相关性；分析AR与syntenin表达情况与患者无病生存期(DFS)的关系；分析AR、syntenin及各个临床参数与DFS的关系。

1.4 统计学分析

应用SPSS 20.0国际专用统计学软件，采用spearman相关分析确定AR与syntenin表达情况和临床病理特点的相关性，并利用Kaplan-Meier生存曲线评价无病生存率，另采用COX比例风险回归模型行多因素分析。

2 结果

2.1 AR与syntenin在三阴性乳腺癌中的表达情况

在80例中30(37.50%)例AR 表达阳性。有79(98.75%)例syntenin表达阳性。

2.2 AR、syntenin表达与乳腺癌临床病理特点的相关性

AR表达与组织学分级呈负相关性(γs=-0.236，P<0.05)，与淋巴结、年龄、组织学分级均无相关性(P>0.05)；syntenin与淋巴结转移状态呈正相关性(γs=0.296，P<0.05)，与肿瘤大小呈正相关性(γs=0.370，P<0.05)，与组织学分级也呈现正相关性(γs=0.230，P<0.05)，与年龄无相关性(P>0.05)，见表1。

表1 AR和sytenin蛋白表达与三阴性乳腺癌临床病理特点的相关性/例

2.3 AR与syntenin表达与患者DFS的关系

80例患者均随访至2013年12月，随访率为100%，平均随访时间(57.26±10.21)个月，其中有18例患者出现复发或转移：3例骨转移，7例局部复发。9例死亡，死亡率为11.25%。无病生存者占77.5%(62/80)，AR阴性与AR阳性患者DFS的关系见图1(χ2=0.480，P=0.489)；不同程度AR表达与DFS的关系见图2(χ2=0.240，P=0.076)；syntenin不同表达程度与DFS的关系见图3(χ2=4.825，P=0.027)。

2.4 单因素分析

淋巴结转移是影响DFS的重要因素(χ2=27.358,P=0.0001)，而年龄、肿瘤大小、病理分级、AR表达、syntenin表达与DFS并无明显相关性(P>0.05)，见表2。

2.5 多变量回归分析

淋巴结转移是独立影响患者DFS的因素(P<0.05)， 且肿瘤直径>5 cm为DFS的危险因素(P<0.05)，见表3。

3 讨论

三阴性乳腺癌者具有特殊的病理特点及临床表现，常有中央坏死及推挤性边缘，且增殖活性较高。此类乳腺癌往往易复发、预后差。据报道，三阴性乳腺癌患者5年无转移生存率约为70.9%，且三阴性乳腺癌手术切除后复发时间较其他类型乳腺癌明显缩短[4-5]。目前针对三阴性乳腺癌尚缺乏有效的靶向治疗，难以取得满意疗效。因此对三阴性乳腺癌病理研究可为临床治疗提供全新方案[6]。本研究对AR与syntenin和三阴性乳腺癌病理特点进行相关分析，同时研究二者表达情况对DFS的影响，以期为该病临床治疗提供全新思路和方向。

图1 AR阴性与AR阳性患者DFS的关系

图2 不同程度AR表达与DFS的关系

图3 不同程度syntenin表达与DFS的关系

临床病理特征DFS/%χ2P年龄0.5060.477 ≤50岁18.92 >5025.58肿瘤大小5.0560.080 ≤2cm13.79 >2cm,≤5cm26.00 >5cm100淋巴结转移27.358<0.0001 无5.56 有57.69病理分级2.060.151 Ⅰ0.00 Ⅱ18.52 Ⅲ28.26AR10.4780.489 -80.00 +73.33AR20.0110.916 (-)、(+)77.27 (++)和(+++)78.57Syntenin10.2940.588 -100.00 +77.22Syntenin23.8240.051 (-)、(+)94.44 (++)和(+++)72.58

3.1 AR与乳腺癌的关系

AR在乳腺癌的发展过程中作用显著，但是确切的机制并不清楚。目前关于AR在三阴性乳腺癌中表达及临床意义尚未得出统一意见。Agoff等在ER阴性的乳腺癌中通过单变量分析发现[7]，AR是 DFS的重要预后因子，但是多变量分析中发现两者无明显关联。Rakha等[8]研究发现，在有淋巴结转移的三阴性乳腺癌中，AR阴性表达者局部复发和远处转移率明显较无淋巴结转移者升高。Hu等发现[9]，在三阴性乳腺癌中AR阳性表达者死亡率增高，但在Ivana等研究中发现AR与DFS和(或)OS无关。本研究发现AR与组织学分级呈现负相关性，但AR与年龄、肿瘤大小、淋巴结情况并无关系。采用多因素分析发现AR表达情况与患者的DFS无相关性，此结果可能与本研究样本量不多有关。

3.2 syntenin与乳腺癌的关系

黑色素瘤分化相关基因9(Mda-9)具有PDZ-1和 PDZ-2结构域，并被重新命名为syntenin[10]。Mda-9/syntenin在不同的细胞中过表达将诱导形成褶皱、中板伪足、扩展和轴突样结构，对质膜结构和功能调整意义重大。通过促使MCF-7或Az-521中mda-9过表达后，可明显增强侵袭和转移的能力[11-12]。相关研究指出[13]，syntenin在多种恶性肿瘤组织中表达明显上调，同时可能参与调节肿瘤侵袭和转移能力，推测mda-9/syntenin可能对粘着斑激酶(FAK)磷酸化有重要促进作用，并且可激活P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)和c-JNK表达。国内有研究通过对160例乳腺癌组织采用免疫乳化法检测SDCBP阳性表达，发现在三阴性乳腺癌组中syntenin表达明显增强，且其表达水平与病理分级、肿瘤组织TNM分期呈正相关性，提示该蛋白表达水平和三阴性乳腺癌患者病理分级及肿瘤分期均存在一定关联，可据此评估病情[14]。本研究结果中，syntenin阳性表达率为98.75%，且其表达水平和淋巴结转移、肿瘤大小、组织学分级均存在紧密关联。与前文研究结论一致，表明在三阴乳腺癌中syntenin高表达很可能预示着不良预后。此外，本研究发现不同syntenin表达和DFS存在明显关联，提示syntenin可能对于患者生存期具有重要决定作用。

综上所述，syntenin与三阴性乳腺癌患者组织学分级、淋巴结转移、肿瘤大小呈正相关性，推测syntenin高水平表达可能和与侵袭能力增强有关。AR与组织学分级相关，但和其它临床特点均无明显关联。AR表达和DFS均无相关性，而syntenin表达和DFS存在明显关联，推测后者可能对患者生存期有重要影响，但尚需要进一步探讨研究。

表3 多变量分析DFS的结果

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ExpressionandSignificanceofARandMda9/syntenininTripleNegativeBreastCancer

HUANGYuankun,ZHOUZhibing,ZHOULeilei.

ChengduFifthPeople'sHospital,Chengdu,611130

ObjectiveTo study the expression and significance of androgen receptor (AR) and ligand binding protein (Mda9/syntenin) in triple negative breast cancer.MethodsExpression of AR and Mda9/syntenin in 80 cases of triple negative breast cancer tissues were detected by immunohistochemical method,and the relationships with clinical pathological characteristics were analyzed.The Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate the disease free survival rate of patients,and the COX proportional regression model were used to carry out multivariate analysis.ResultsThe positive expression rate of AR was 37.50%,and the positive expression rate of syntenin was 98.75%.The expression of AR was negatively related with histological grading (γs=-0.236,P<0.05),while the expression of syntenin was positively related with lymph node metastasis (γs=0.296,P<0.05),and positively related with tumor size (γs=0.370,P<0.05),as well as with histological grading (γs=0.230,P<0.05).The disease free survival accounted for 77.5%(62/80).There had no significant differences in disease free survival (DFS) between the AR negative and AR positive patients,and different degrees of AR expression (P>0.05),while the different degrees of syntenin expressions were significantly correlated with DFS (P<0.05).The single factor analysis showed that lymph node metastasis was an important factor affecting the DFS (P<0.05),and the multi-factor analysis showed that both lymph node metastasis and tumor larger than 5cm were risk factors affecting DFS (P<0.05).ConclusionThe expression of AR is related with histological grading,and the expression of syntenin is positively related with histological grading,lymph node metastasis and tumor size,which is obviously related with DFS.

Androgen receptor (AR);Melanoma differentiation associated gene 9(Mda9);Ligand binding protein(syntenin);Triple negative breast cancer;Clinical pathology

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1763～1767)

611130 成都市第五人民医院(黄元坤)；330000 南昌市第三人民医院(周志兵)；610072 四川省人民医院(周蕾蕾)

周蕾蕾

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.007

R737.9

A

1001-5930(2017)11-1763-05

2016-10-09

2017-07-10)

(编辑：吴小红)