微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏中的应用

王伟，冷凯良，刘均忠，郝建华，孙谧*

1(中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部极地渔业开发重点实验室，山东 青岛，266071)2(青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛，266235)

微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏中的应用

王伟1,2，冷凯良1，刘均忠1,2，郝建华1,2，孙谧1,2*

1(中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部极地渔业开发重点实验室，山东 青岛，266071)2(青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛，266235)

简介了微生物扩增子高通量测序技术，简述该技术在水产品加工与贮藏研究中的应用现状。在发酵水产品、水产品低温加工和保鲜防腐等方向，众多研究以高通量方法测定细菌和古菌的16S rRNA基因片段，准确获得水产品中微生物的种类和数量信息。微生物扩增子高通量测序技术优于传统的可培养法，也优于许多非培养分析技术。同时还指出了该技术的存在问题及对策，并探讨了该技术的发展方向和应用前景。

扩增子高通量测序;16S rRNA基因;水产品加工与贮藏;微生物检测

新1代测序(next-generation sequencing, NGS)是区别于经典的桑格测序法的革命性技术，近十几年迅速发展，已成为主流的测序方法，实现了高通量测序(high throughput sequencing, HTS)[1]。高通量测序使核酸测序成本大幅度下降，从而推动了生命科学各学科的发展[2]。在食品微生物生态学领域，高通量测序技术已成为最重要的非培养技术，主要用于16S rRNA等基因的扩增子(amplicon)测序[3]。扩增子高通量测序可以检测食品中微生物群落的结构及时空动态变化[4]，为提高食品质量和安全管理水平提供指导。在水产品加工与贮藏领域，目前国内外学者在发酵水产品、水产品低温加工和保鲜防腐等方向也开始应用微生物扩增子高通量测序技术，获得了理想的结果。本文述评微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏研究中的应用现状，并展望该技术的发展趋势。

1 微生物扩增子高通量测序技术简介

16S rRNA基因是用于细菌和古菌分类鉴定的主要基因[5]，目前应用广泛的第2代测序仪的测序读长无法覆盖该基因的1.5 kbp全长，只能测定16S rRNA基因的一段序列。该基因序列含有间隔排列的10个保守区和9个高变区(V1-V9)，可以根据高变区侧翼的保守区设计简并PCR引物，选择性扩增特定的高变区[6]。提取待测样品的总DNA后，以PCR方式获得其中细菌和古菌的16S rRNA基因片段并构建扩增子文库。对文库中的PCR产物高通量测序，就能获得每个样品中数万条甚至十几万条16S rRNA基因片段的序列，再以生物信息学的方法去除错误的测序结果，划定微生物操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)，并和参考数据库中已知的微生物基因比较，确定OTU的分类学地位。最后进行微生物生态学分析，计算多样性指数，进行系统发生树分析、菌群差异分析、多维度分析和功能预测分析等[7]。

基于焦磷酸测序原理的454测序系统是最先上市的高通量测序平台[8]，但由于测序费用偏高目前已被最主流的Illumina公司测序仪取代。Illumina的HiSeq2500和MiSeq测序仪是16S rRNA基因扩增子测序的最常用平台，最大读长分别为2×250 bp和2×300 bp。赛默飞世尔公司的基于半导体测序原理的Ion PGM测序仪读长可达400 bp，也用于16S rRNA基因扩增子测序[9]；较新的Ion S5测序仪读长可达600 bp。Pacific Bioscience公司的第3代测序仪PacBio RS II和Sequel的读长都超过20 kbp；Oxford Nanopore公司的第3代测序仪MinION读长超过6 kbp[2]。目前以第3代测序仪开展16S rRNA基因高通量测序的研究报道较少。

2 微生物扩增子高通量测序技术的主要优势

水产品微生物的研究技术中，16S rRNA基因扩增子高通量测序是一种非培养分析法(culture-independent analysis)，它克服了传统的培养法对培养基、培养温度等培养条件的依赖，直接从样品DNA中确定门、纲、目、科、属等各个分类学等级上的微生物的种类和相对丰度，可以获得样品中大多数微生物的信息。在其他非培养分析法中，荧光定量PCR(qPCR)只能检测微生物总量和某类微生物数量；限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)，变性梯度胶凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)，温度梯度胶凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)等技术都以PCR扩增16S rRNA基因片段，但后续分析依赖电泳和传统的桑格测序，结果的准确度以及检测到的微生物种类数都无法和16S rRNA扩增子的高通量测序相比。微生物扩增子高通量测序还易于开展样品的高通量分析，即同时对大量样品开展研究[4]。因此，这一技术在水产品加工和贮藏领域的应用日趋广泛(表1)。

表1 微生物16S rRNA基因扩增子高通量测序在水产品加工和贮藏中的应用Table 1 High-throughput microbial 16S rRNA amplicon sequencing in the study of processing and storage of aquatic food

注：*V1-V3区为细菌测序，V3-V5区为古菌测序。

3 水产品加工领域的应用

微生物扩增子高通量测序可用于检查水产品加工过程中微生物污染。MØRETRØ等[12]监测7个加工厂的大西洋鲑鱼片，发现主要污染菌是假单胞菌(Pseudomonas)和希瓦菌(Shewanella)。在水产品发酵工艺中应用高通量测序的报道较多：ROH等[21]发现7种发酵海鲜产品的古菌种类都多于细菌，其中6种产品的嗜盐古菌为优势菌；KOYANAGI等[22-24]发现在咸鱼寿司发酵过程中，乳酸菌占绝对优势；盐发酵的日本毛虾在不同的温度、盐浓度和发酵时间等条件下取样检测，菌群变化情况为最优发酵条件的选择提供了重要依据[25-27]；吴燕燕等比较传统法和新型乳酸菌法腌干鱼的发酵工艺，发现新工艺方法获得的样品中有益微生物占优势[29]；于美娟等发现传统固态发酵鱼制品中细菌多样性丰富，但具有潜在危害的细菌种类也较多[30]。

4 水产品贮藏领域的应用

国内外学者以扩增子高通量测序法对各种水产品在不同保藏条件下菌群随时间的变化及腐败菌进行了检测。CHAILLOU等[10]发现腐败的鳕鱼片中优势菌为未知的梭杆菌(Fusobacteriales)，而腐败的鲑鱼片中有高温菌Hydrogenophilushirshii和Geobacillusdebilis，可能来自低温养殖环境；CALLIAUW等[13]发现4 ℃气调包装的去皮褐虾(Crangoncrangon)腐败时，可培养方法和高通量测序法能检测出的细菌种类相似，但相对丰度差别较大；王晶晶等[16]检测辐照真空包装的象拔蚌(Panopeaabtupta)，当电子束和γ射线两类辐照剂量高于4 kGy时，两类产品中优势腐败菌均为变形细菌(Proteobacteria)；储建军等[17]发现缢蛏(Sinonovaculaconstricta)冰温保活期终点的优势腐败菌为假单胞菌；朱迎春等[18]发现气调包装协同冰温贮藏革胡子鲶(Calariasgariepinus)鱼片显著降低了细菌的多样性和丰度，添加保鲜液能抑制主要腐败菌乳球菌(Lactococcus)。

高通量测序法在应用中充分展示出前述的优势，能检出培养法无法检出的难培养的优势微生物，还能确定样品中大多数微生物的相对丰度。不过上述部分研究也说明其检测结果和传统培养法及其他非培养方法的结果不是完全一致的[13-14]。

5 存在问题

微生物扩增子高通量测序在水产品加工和贮藏中的应用研究报道几乎均为细菌和古菌的16S rRNA基因测序，未见真菌转录间隔区(ITS)，18S rRNA或26S rRNA基因测序。这可能和水产品研究中对真菌关注较少有关。对真菌进行高通量测序检测，有可能发现潜在的有益或有害真菌。

由于DNA稳定性较好，高通量测序前提取样品的总DNA中含有暂未降解的已死亡的微生物DNA，以致研究者无法确定检测到的微生物是否存活[31]。有3种方案可解决该问题：根据RNA易降解的性质，直接提取样品中总RNA并反转录为cDNA，就能检测活菌的基因[32]。CHAILLOU等[10]使用NucleoSpin®Plant II试剂盒去除已裂解死亡的微生物的DNA。肖莉莉等[15]使用叠氮溴化丙锭(PMA)预处理南美白对虾样品，去除死亡菌体DNA后再进行完整细胞中DNA的提取。PMA作为一种无法进入完整细胞内部的DNA结合光敏试剂，已用于荧光定量PCR检测的预处理[32]。和常规DNA提取法相比，上述3种方法成本高且操作复杂，并未广泛使用，但今后可能会成为主流方法。

样品总DNA中16S rRNA基因的拷贝数在不同种的菌体中存在差异，一般在1～15；同一菌体的16S rRNA基因多个拷贝之间也存在差异[33]。而16S rRNA基因高通量测序的结果默认一个微生物细胞产生1条序列，这就导致多样性和丰度被高估或低估[34]。真菌ITS区也存在类似问题[31]。样品总RNA还存在基因转录数的差异。对不同种类的微生物16S rRNA基因拷贝数变异问题，有报道以新算法和新软件改进分析结果的准确度[35]，但尚未广泛使用。对于细菌种内16S rRNA基因多拷贝差异导致多样性被高估的问题，SUN等认为16S rRNA基因V4～V5区的种内变异度最低，推荐作为高通量测序的目标区域[36]。

目前16S rRNA基因扩增区域的选择没有统一标准，也没有针对某类水产品或其他食品微生物检测的专门引物。由于16S rRNA基因的差异，不存在能扩增所有原核生物类群的通用引物[6]。有报道，选择V1～V2区有利于乳酸菌的分类鉴别[37]，但一般选择V3～V4或V4～V5区。这两个区域的基因片段长度满足Illumina测序仪的测序能力，也有相应的通用简并引物能扩增大多数原核生物的类群[38-39]。

增加16S rRNA基因片段的测序长度有助于提高微生物分类的准确性。基于单分子实时测序原理的第3代测序仪PacBio RS II测定近16S rRNA基因全长的V1～V9区，证明了近全长基因能提供更完整的微生物群落组成信息[40]。ZHENG等以此方法检测了婴儿配方奶粉中细菌的种类[41]。基于纳米孔测序原理的小型便携式第3代测序仪MinION可以将模拟细菌群落的全长16S rRNA基因鉴定到种[42]。第3代测序仪不仅读长较长，测序时间也较短[2,43]；MinION还有现场测序的优势。第3代测序技术有取代现有2代测序平台的潜力，但测序准确度尚不及2代测序，且成本过高；现有分析软件和数据库多数都是基于2代平台的测序数据[43]。因此3代测序平台在微生物扩增子测序领域暂时无法广泛应用。预计Illumina测序平台在今后一段时期内仍是主流，细菌多样性研究仍将基于16S rRNA基因部分区域的测序结果[6]。检测真菌也和检测细菌的16S rRNA基因类似，扩增真菌的ITS1，ITS2，18S rRNA V4等区域的许多通用引物都用于食品微生物多样性研究[3]。今后高通量测序研究内容仍将是众多引物扩增各种基因片段，不同基因片段测序结果之间的比较仍存在问题。

6 发展趋势与展望

随着高通量测序成本不断降低和生物信息学的发展，宏基因组(metagenome)测序有可能成为研究水产品加工和贮藏中微生物种类、丰度和功能的重要方法。目前食品领域该技术仅在乳制品发酵研究中有报道[3]。宏基因组测序无需PCR扩增，能够克服上述基因拷贝数和基因片段选择的问题，同时检测水产品中的原核生物、真菌、其他真核微生物及病毒的基因组，获得微生物群落中重要的功能基因[2]。因此宏基因组测序可以补充扩增子高通量测序的结果。

微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏研究中尚未为主流研究方法，主要原因是其费用不仅高于培养法，还高于16S rRNA基因克隆文库RFLP/qPCR/DGGE等非培养方法；而且高通量测序对研究技能提出了更高要求，研究人员要掌握生物信息学相关的分析能力[4]。高通量测序耗时较长无法快速获得结果，这也是影响其应用的重要原因。因此近期内高通量测序不会替代传统的培养法成为水产品加工和贮藏的常规检测技术。不过随着食品质量和安全越来越受到政府和群众的重视，水产品加工和贮藏各环节的质量提升和隐患排查也越来越依赖先进的科技手段；由于微生物对水产品质量和安全的重要影响，微生物扩增子高通量测序也将更多地应用于水产品加工和贮藏研究中，并综合其他检测方法，指导改善生产管理，提高产品质量和安全性能。

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High-throughputmicrobialrRNAampliconsequencinginthestudyofprocessingandstorageofaquaticfoodproducts

WANG Wei1,2, LENG Kai-liang1, LIU Jun-zhong1,2, HAO Jian-hua1,2, SUN Mi1,2*

1(Key Laboratory of Development of Polar Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)2(Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China)

Food microbiology has been revolutionized by the advances in molecular genetic technology of microbial ecology. Novel microbial detection methods have been applied in the study of processing and storage of aquatic food products. The microbial diversity in the sample to be studied could be detected by high-throughput sequencing (HTS) approaches as culture-independent analyses. The aim of this review is to give a brief introduction of the microbial amplicon HTS technology, to present a survey of recent aquatic food investigations via 16S rRNA amplicon HTS and to illustrate the potential of this approach for a valuable tool in the better characterization of aquatic foods and their processing and storage.

shigh-throughput amplicon sequencing; 16S rRNA gene; processing and storage of aquatic products; microbe detection

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014760

博士，副研究员(孙谧研究员为通讯作者,E-mail：sunmi@ysfri.ac.cn)。

中国水产科学研究院基本科研业务费项目(2016HY-ZD0902)；青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2016ASKJ14)

2017-05-14，改回日期：2017-06-29