大肠杆菌不同菌株木糖代谢差异性的遗传本质

孙金凤，田康明，沈微，陈献忠，王正祥*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(天津科技大学 化工与材料学院，天津，300457)3(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安，223003)

大肠杆菌不同菌株木糖代谢差异性的遗传本质

孙金凤1,3，田康明2，沈微1，陈献忠1，王正祥2*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(天津科技大学 化工与材料学院，天津，300457)3(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安，223003)

在木糖无机盐培养基中，不同大肠杆菌菌株的生长速率存在较大差异。在缓慢生长菌株EscherichiacoliB0013和E.coliB2198中表达快速生长菌株E.coliK12的木糖运输和分解代谢的2个操纵子(xylBA-xylFGH)，能够显著提高其利用木糖生长的速率。进一步研究发现，单独表达木糖运输基因xylFGH即可以显著提高菌株起始生长速率。对菌株K12、B0013和B2198的xylFGH基因序列进行测定和分析比对，发现菌株B0013和B2198利用木糖生长缓慢是由于木糖运输载体基因发生无义突变而导致读框中断，B0013的xylH基因中TGG突变为TAG(Trp126*)，B2198的xylG基因中CGA突变为TGA(Arg241*)，木糖运输效率低下。在B0013中过量表达其自身的另一种木糖运输载体基因xylE或调控基因xylR，可以适当提高其生长速率。但是木糖高效运输系统xylFGH缺陷而导致的生长缓慢表型，并不能够仅仅通过表达低效运输载体基因xylE而显著改善。对菌株B0013的xylH基因进行回复突变，突变株恢复快速生长表型。测序结果发现，xylH基因第126个密码子因无义突变而形成的终止密码TAG，重新回复为Trp密码TGG。

大肠杆菌；木糖运输载体；生长差异分析；回复突变；遗传本质

木质纤维素乙醇是有望替代化石能源的最具代表性的生物质燃料。但是木质纤维素水解液中组成糖类复杂，不仅含有己糖还有戊糖，主要是葡萄糖和木糖，其中木糖是自然界中除了葡萄糖之外含量第2的碳水化合物[1-2]。传统的乙醇生产菌种Saccharomycescerevisiae不能够发酵木糖[3]，而Escherichiacoli作为转化可再生的生物质资源生产燃料和化学品的重要菌种，具有很多优良特性，其中最令人感兴趣的特性是其既能够代谢己糖，也能代谢戊糖，但2者的代谢方式明显不同[2]。

从E.coli中已经纯化并鉴定了2种D-木糖特异性运输系统，即亲和力相对较低的D-木糖/H+同向运输载体XylE和高亲和力的D-木糖运输载体XylFGH。木糖运输载体基因xylFGH和xylE受XylR的调控[2]。E.coli中木糖运输主要是通过高亲和力载体xylFGH[4-5]，木糖运输进入细胞后，通过磷酸戊糖途径进行分解代谢。D-木糖首先由木糖异构酶XylA催化，异构化形成D-木酮糖，然后由木酮糖激酶XylB催化形成D-木酮糖-5-磷酸。编码木糖分解代谢酶的基因xylAB和编码运输载体的基因xylFGH在E.coli染色体上相邻排列但读框方向相反[6-7]。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

本研究所用的菌株和质粒见表1。所有培养物均以15%甘油管形式于-70 ℃保藏在中国高校工业微生物资源中心(http://CICIM-CU.jiangnan.edu.cn)。菌株E.coliK12由中心保藏；E.coliB0013、B2198由本研究前期筛选并保藏。培养物在LB培养基中进行培养，必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素(Amp)或50 μg/mL卡那霉素(Km)。用于本研究基因克隆与表达的质粒有pMD18T-simple、pTH18Kr和pTH18Ks1[10]。

1.2 分子克隆与重组质粒的构建

DNA的酶切、连接、转化、电转化、PCR和克隆等通用操作参照分子生物学标准操作进行[11]。除非特别说明，所有PCR采用TaKaRa PrimerSTAR DNA polymerase(宝生物工程(大连)有限公司)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

重组质粒pTH-xylB-H的构建。以E.coli不同菌株的染色体DNA为模板扩增，以引物xylB-H1-p1和xylB-H1-p2扩增木糖运输操纵子的DNA序列 (xylFGH)，获得扩增产物xylB-H1；以引物xylB-H2-p1和xylB-H2-p2扩增木糖分解代谢操纵子序列(xylBA)，获得扩增产物xylB-H2。扩增产物xylB-H1经EcoRI和BamHI酶切，克隆入经同样酶切的载体pTH18Kr，得到pTH-xylB-H1。PCR产物xylB-H2直接克隆入pMD18T-simple中，得到pMD18T-xylB-H2。经NcoI(NcoI位点位于xylG内部)和BamHI酶切pMD18T-xylB-H2，分离xylB-H2′片段；将此片段连接到同样经NcoI和BamHI酶切的质粒pTH-xylB-H1中，得到重组质粒pTH-xylB-H，其含有完整的xylBA和xylFGH操纵子。

相似地，分别构建含有xylFGH、xylBA、xylR、xylE基因的重组质粒pTH-xylFGH、pTH-xylBA、pTH-xylR及pTH-xylE。

1.3 细胞增殖与碳源利用试验

从LB平板接种新鲜菌落到50 mL LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜，然后离心收集细胞，用M9培养基洗涤重悬，作为种子液。接种含有5 g/L木糖的100 mL改良M9培养基，使得初始OD600为0.1，37 ℃、200 r/min振荡培养，定期取样测定OD600。

M9基本培养基组成(1 L)：15.11 g Na2HPO4·12H2O, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0.5 g NaCl。进行培养试验时，添加0.1 % MgSO4和0.1 %微量金属离子储备液，得到改良M9培养基。

(1)用Anycasting模拟仿真技术，对壳体结构进行了分析．结合设计准则及经验设计出一种浇注系统，再对浇注系统进行模拟并就模拟结果进行优化，以铸件缺陷情况确定选择最适合该壳体生产的浇注系统．

微量金属离子储备液组成(1 L)：2.4 g FeCl3·6H2O, 0.3 g CoCl2·6H2O, 0.15 g CuCl2·2H2O, 0.3 g ZnCl2, 0.3 g Na2MoO4·2H2O, 0.075 g H3BO3, 0.495 g MnCl2·4H2O[12]。

LB培养基和M9培养基均在121 ℃高压蒸汽灭菌15 min备用。

微量金属离子贮备液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。500 g/L木糖贮备液在115 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。所有的培养试验是在500 mL摇瓶中进行，平行测定3次。所有结果都是3次平行测定的平均值。

1.4 分析方法

采用UNICO UV2000分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)测定600 nm的吸光度值 (OD600, 1 cm光程) 监控培养过程的细胞密度。吸光度值与细胞干重之间关系的标准曲线显示：OD600为1.0相当于0.38 g/L细胞干重(DCW)。培养过程中细胞生长速率(dX/dt)与细胞浓度X呈正比，满足方程式(1)：

(1)

平均比生长速率可以通过方程式(2)计算：

lnXt-lnX0=μt

(2)

式(1)和(2)中：dX/dt，细胞生长速率；μ，比生长速率；X，细胞浓度；t，培养时间；Xt、X0，分别为t时刻和初始的细胞浓度。

DNA序列测定是根据Applied Biosystems指导手册进行，运用Sequence Scanner (Applied Biosystems)软件进行DNA序列分析。为确保测序结果的可靠性，部分样品寄往宝生物工程(大连)有限公司进行测序确认。

2 结果与分析

2.1 不同大肠杆菌菌株利用木糖生长的速率不同

在M9木糖培养基中培养实验菌株E.coliK12和工业生产菌株E.coliB0013、B2198，结果发现K12的生长速率明显快于B0013和B2198。在37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，K12的细胞密度(OD600)为5.7，而B0013和B2198分别为0.8和0.4，不同菌株在M9木糖培养基中的生长速率差异显著。

2.2 表达E. coli K12木糖高效运输系统可显著改善E. coli B0013和B2198木糖利用

采用分子克隆技术，分别从E.coliK12、B0013以及B2198菌株的染色体中克隆出含有木糖运输(xylFGH)和分解代谢(xylBA)的两个相邻操纵子，获得相应的重组质粒pTH-xylB-H。将所构建的重组质粒以及pTH18Kr转化E.coliK12、B0013或B2198。转化子分别在M9木糖培养基中培养，监测其利用木糖生长的状况，结果如图1所示。

1-E. coli K12; 2-E. coli K12(pTH18Kr); 3-E. coli K12(pTH-K12xylB-H); 4-E. coli B0013; 5-E. coli B0013(pTH18Kr); 6-E. coli B0013(pTH-B0013xylB-H); 7-E. coli B0013(pTH-K12xylB-H); 8-E. coli B2198; 9-E. coli B2198(pTH18Kr); 10-E. coli B2198(pTH-B2198xylB-H); 11-E. coli B2198(pTH-K12xylB-H)图1 M9木糖培养基中大肠杆菌重组菌及对照菌株的生长Fig.1 Growth properties of the E. coli recombinants in M9-xylose medium

很显然，E.coliK12、B0013和B2198表达自身xylB-H对于菌株在M9木糖培养基中的生长没有明显影响。然而，在缓慢生长菌株B0013和B2198中表达快速生长菌株K12的xylB-H，重组菌比原始菌株和转化质粒pTH18Kr的对照菌株利用木糖生长明显加快。在37 ℃、200 r/min培养12 h，表达pTH-K12xylB-H的B0013和B2198细胞密度(OD600)分别达到4.7和4.1，而相应的原始菌株分别为0.6和0.3 (图1)。B0013(pTH-K12xylB-H)和B2198(pTH-K12xylB-H)的平均比生长速率μ分别为0.32 h-1和0.31 h-1，显著高于原始菌株B0013(μ=0.15 h-1)和B2198(μ=0.091 h-1)。

为了确定E.coliK12木糖操纵子中何种组分，对提高B0013生长速率起主要作用，将K12中负责木糖运输(xylFGH)和分解代谢(xylBA)的2个操纵子在B0013中单独表达和同时表达。结果表明，在B0013中仅表达K12的木糖运输组分与同时表达木糖运输和分解代谢组分，对于重组菌在M9木糖培养基中的生长具有相似的影响(图2)。

◇B0013(pTH18Kr); □B0013 (pTH-K12xylBA); △B0013 (pTH-K12xylFGH);B0013 (pTH-K12xylB-H)图2 E. coli B0013重组菌在M9木糖培养基中的生长Fig.2 Growth properties of E. coli B0013 recombinants in M9-xylose medium

在37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，重组菌B0013(pTH-K12xylB-H)和B0013(pTH-K12xylFGH)生长进入稳定期。而相同条件下，B0013(pTH-K12xylBA)和B0013(pTH18Kr)尚处于生长迟滞期，B0013(pTH-K12xylBA)比B0013(pTH18Kr)生长稍快。因此，菌株B0013利用木糖缓慢的可能原因是其木糖运输途径出现问题。

2.3 E. coli B0013和B2198木糖利用缓慢的原因是其木糖转运系统编码基因发生无义突变

对B0013、B2198的xylFGH基因进行测序，并与K12的xylFGH序列进行比对分析，结果显示，B0013的xylH基因第126个密码(Trp密码TGG)、B2198的xylG基因第241个密码(Arg密码CGA)发生点突变。B0013的xylH基因中，G突变为A导致Trp密码TGG无义突变为终止密码TAG(Trp126*)，B2198的xylG基因中，C突变为T导致Arg密码CGA无义突变为终止密码TGA(Arg241*)。无义突变导致读框中断，相应的木糖运输蛋白组分不能正确表达，影响了木糖的正常运输。

进一步考察了其他因子，如另一种木糖运输载体xylE或转录因子xylR，对B0013菌株利用木糖的影响，构建了质粒pTH-B0013xylR和pTH-B0013xylE，转化B0013菌株。结果表明，增加xylE和xylR的表达，能够适当提高B0013的生长速率，且过量表达xylR的效果略低于过量表达xylE(图3)。这一结果进一步说明增加B0013菌株的木糖运输可以改善其利用木糖生长的速率。

由于高亲和力D-木糖运输载体XylFGH缺陷而导致的缓慢生长表型不能够仅仅通过过量表达XylE而显著改善，因为XylE作为D-木糖运输载体，亲和力较低。HASONA等[4]曾报道，XylE不是木糖运输的主要载体，即便在两种运输载体都饱和的情况下，XylFGH运输体系仍是主要的木糖运输系统。

进一步在B0013中表达K12的XylFGH，B0013菌株利用木糖的起始生长速率明显得到改善，但是到达稳定期的细胞密度(OD600=4.7)低于其他 B0013重组菌(OD600=6.0, 6.5, 7.0)(图3)。过量表达XylFGH可能增加了B0013菌株中生物合成的负担，因而限制了稳定期的细胞密度。

2.4 xylH基因回复突变重建了E. coli B0013利用木糖快速生长表型

构建含有E.coliK12的xylH基因部分序列的重组质粒pTH18Ks1-K12xylH′，并转化B0013，用木糖平板筛选快速生长菌株。将平板上所获得的4株快速生长菌株进一步在M9木糖培养基中培养，结果表明有4株B0013突变株利用木糖的快速生长表型恢复(细胞密度达到OD600=5.0)，而对照菌株的细胞密度(OD600)为0.6。突变株的平均比生长速率μ为0.33 h-1，是对照菌株B0013(μ= 0.15 h-1)的2倍多(图4)。

1-E. coli B0013; 2,3,4,5,6-xylH reverse mutants B0013H*1-74, 2-68, 3-8, 3-9, 3-75图4 M9木糖培养基中菌株B0013及其回复突变株B0013H*的生长Fig.4 Growthproperties of E. coli CICIM B0013 and its reverse mutants B0013H* grown in xylose M9 medium overnight

将突变株在42 ℃连续转接培养，去除温度敏感型质粒pTH18Ks1-K12xylH′，质粒丢失后突变株在添加50 μg/mL卡那霉素的培养基上不再生长。对B0013突变株的xylH基因进行序列测定和分析，xylH基因第126个密码从TAG回复突变为TGG，跨膜蛋白xylH正确表达，能够高效运输木糖，因而菌株恢复快速生长表型。该xylH回复突变株记为B0013H*。

3 讨论

尽管大量研究揭示，菌株E.coliB0013具有优良的工业应用性能并成功应用于多个重要工业产品的生产[13-18]，但在开发其利用木质纤维素资源时发现，其木糖代谢存在缺陷。本研究基于实验菌株E.coliK12在M9木糖培养基中的生长速率明显快于工业生产菌株E.coliB0013和B2198的实验结果，发现菌株利用木糖生长缓慢的原因可能是其木糖运输途径缺陷。对木糖运输载体基因xylFGH进行测序和比对分析，发现B0013的xylH基因和B2198的xylG基因发生了无义突变，导致读框中断，相应的木糖运输蛋白组分不能正确表达，影响了木糖的运输和利用。

本研究通过探索造成不同大肠杆菌菌株利用木糖生长速率差异的遗传本质，确证了高亲和力运输载体XylFGH突变对菌株利用木糖生长的速率具有显著降低效应。通过分子重组回复突变，B0013利用木糖的快速生长表型得以恢复，为菌株后续的代谢工程改造与应用奠定了基础。

自然界中一些微生物本身可以利用木糖而很多微生物不能利用。为了赋予或提高目标微生物的木糖利用能力，人们通过遗传工程引入戊糖利用途径[19]，或者采用驯化培养的方法(适应性进化)改善天然菌株或遗传改造菌株的木糖利用特性[6,20-21]。本研究在已知影响大肠杆菌菌株木糖利用的原因后有针对性地诱导回复突变，提高菌株的木糖利用能力。木糖的高效利用对于充分利用木质纤维素水解糖类生产燃料或其他化学品具有重要意义，有利于降低生产成本，提高生产效率。

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GeneticnatureofxylosemetabolismdiversityofdifferentEscherichiacolistrains

SUN Jin-feng1,3, TIAN Kang-ming2, SHEN Wei1,CHEN Xian-zhong1, WANG Zheng-xiang2*

1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)3(School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China)

It was found that growth rate of differentEscherichiacolistrains differed evidently when incubated in xylose minimal medium. Expression of two reversely adjacent xylose metabolism operons (xylBA-xylFGH) from rapid growingE.coliK12 in slow growingE.coliB0013 and B2198 increased their growth rates on xylose. Results showed that expression of xylose transporter genexylFGHalone also significantly increased initial growth rate of the recombinants. DNA sequencing and analysis ofxylFGHin K12, B0013 and B2198 indicated that the 126thcodon TGG changed to TAG (Trp126*) inxylHof B0013 and the 241stcodon CGA changed to TGA (Arg241*) inxylGof 2198 which caused interrupted reading frames and therefore deficiency in xylose transporters and was responsible for the slow growth phenotype. Overexpression of its own another xylose transporter genexylEor regulator genexylRslightly increased the growth rate of B0013. However, slow growth on xylose due to the deficiency inxylFGHcannot be significantly improved by overexpression ofxylEalone because XylE is a relatively low-affinity xylose transporter. Reverse mutation ofxylHin B0013, verified by DNA sequencing (the 126thcodon TAG changed back to TGG), restored its rapid growth phenotype.

Escherichiacoli; xylose transporter; growth difference analysis; reverse mutation; genetic nature

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013596

博士研究生，副教授(王正祥教授为通讯作者,E-mail: zx.wang@tust.edu.cn)。

2016-12-12，改回日期：2017-06-13