CTB增强PsaA疫苗对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用

戴文佳 梁琼 刘向 李雯 徐江红

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科（上海200031）

CTB增强PsaA疫苗对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用

戴文佳 梁琼 刘向 李雯 徐江红

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科（上海200031）

目的研究以霍乱毒素B(CTB)作为PsaA蛋白疫苗黏膜佐剂经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用。方法6～8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组，分别接受PsaA蛋白免疫（PsaA组，15µgPsaA蛋白），PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB组，15µgPsaA/4µgCTB),CTB免疫（CTB组，4µgCTB），经鼻腔途径免疫，相同剂量和方法每周免疫两次，连续三周，末次免疫后两周收集鼻腔灌洗液、中耳灌洗液及支气管肺泡灌洗液检测特异性IgA抗体反应；收集血清，检测特异性IgG、IgG1及IgG2a抗体反应；末次免疫后2周，小鼠经鼓膜注射14型肺炎链球菌，攻毒后5天组织病理学评估中耳炎症程度。结果PsaA/CTB组鼻腔黏膜免疫获得了较高水平的全面免疫应答：鼻腔、中耳和支气管肺泡灌洗液中特异性IgA抗体水平明显高于PsaA组和CTB组（P＜0.05）；血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平明显高于PsaA组和CTB组（P＜0.05）；攻毒后5天PsaA/CTB组中耳炎症细胞数少于PsaA和CTB组（P＜0.05）。结论CTB是肺炎链球菌蛋白疫苗PsaA有效的黏膜免疫佐剂，黏膜免疫也是PsaA有效的免疫途径，该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础。

霍乱毒素B；肺炎链球菌；黏膜免疫；PsaA；急性中耳炎

急性中耳炎是耳鼻喉科常见病，多发病，尤其在儿童中发病率更高。大约有85%的儿童到三岁时至少患过一次中耳炎，40%的儿童至少患过6次急性中耳炎[1]，急性中耳炎患儿是儿童内科医师门诊和应用抗生素处方的主要对象，急性中耳炎不仅可能导致中耳积液的持续存在，形成慢性分泌性中耳炎，从而引起患儿的听力下降[2]，也可能引起严重的颅内外并发症，需要手术干预[3]，对患儿的生活质量造成较为严重的不良影响。总之，急性中耳炎不仅影响患儿的生活质量，也占用了一定的医疗卫生资源，导致经济和社会负担，从卫生经济和疾病预防控制角度上考虑，疫苗接种预防中耳炎可能是最佳的选择，急性中耳炎的早期预防也将减少并发症的发生[4]。

肺炎链球菌是急性中耳炎最常见病原体，20～35%的急性中耳炎是由肺炎链球菌引起[5]。最早的23价肺炎链球菌多糖疫苗对于2岁以下的儿童无效[6]。为增强疫苗在幼儿体内的免疫应答，发展了多糖蛋白结合疫苗,多糖蛋白结合疫苗虽然已经显示能明显降低侵袭性肺炎链球菌疾病的发病率，但是对于黏膜感染疾病急性中耳炎的整体发病率的影响很小[7]。随着肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗的广泛应用，发生了越来越多的血清型漂移和急性中耳炎其他病原体感染的增加[8]。另外已经上市的多糖蛋白结合疫苗价格昂贵，并不适合在发展中国家推广使用。肺炎链球菌有90余种血清型，不断增加偶联的多糖种类显然不是明智之举，为预防各种血清型肺炎链球菌引起的急性中耳炎需要发展无血清型限制的新型肺炎链球菌疫苗。近年来，以肺炎球菌表面保守蛋白为基础的无血清型限制的新型肺炎球菌疫苗成为研究热点[9]。肺炎链球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesion A,PsaA)就是其中之一。PsaA免疫降低肺炎链球菌鼻咽部的定植已在多项实验研究中证实，但对于急性中耳炎的保护作用研究较少[10]。我们曾以壳聚糖为PsaA蛋白黏膜输送系统，已证实可以对急性中耳炎产生保护作用[11]。而霍乱毒素（cholera toxin，CT）是在动物实验中证实最有效的黏膜佐剂，然而其潜在的毒性限制了其在人类的应用，其无毒性亚型霍乱毒素B（CTB）因同样具有强烈的生物学作用以及黏膜佐剂特性，已经代替CT得到广泛使用[12]，并且证实在人类可以使用[13]，而CTB是否可以增强PsaA蛋白疫苗对急性中耳炎的保护作用并无相关研究报道。因此本研究以霍乱毒素B(CTB)作为PsaA蛋白疫苗黏膜佐剂并经鼻腔黏膜途径免疫，研究其在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，重16～18g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；攻毒前饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部SPF级实验室，攻毒后饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部生物安全2级实验室（ABSL-2级实验室）。

1.2 菌株及培养基

14型肺炎链球菌购自中国医学细菌保藏管理中心（产品编号：31226）；肺炎链球菌液体培养基Todd-Hewitt Broth为Sigma公司产品，固体培养基哥伦比亚血琼脂平板为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品。

1.3 主要试剂

霍乱毒素B（CTB）为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgA抗体为Life Technologies公司产品；HRP标记的羊抗小鼠IgG为Yeasen公司产品；HRP标记的羊抗小鼠IgG1、IgG2a为Proteintech公司产品；TMB（3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine）底物溶液购自eBioscience公司。

1.4 主要实验仪器

Thermo Scientific Forma 310 CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific公司）；Leica生物荧光显微镜（德国Leica公司）；Zesis解剖显微镜（德国Zesis公司）。VICTOR3™V多标记酶标仪（美国PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司）。

1.5 方法

6～8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组，每组16只，分别接受PsaA蛋白免疫（PsaA组，15µgPsaA蛋白），PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB组，15µgP-saA/4µgCTB)，CTB免疫（CTB组，4µgCTB），经鼻腔途径免疫，相同剂量和方法每周免疫两次，连续三周。末次免疫后两周，每组随机取6只小鼠用于采集血清及采集支气管肺泡灌洗液（BALF）、鼻腔灌洗液(NW)以及中耳灌洗液(MEL)，每组随机取10只小鼠用于中耳注射肺炎链球菌。

动物末次免疫后两周采用摘除眼球方法采血，分离血清，即用左手将小鼠固定，压迫颈部并拉紧头部皮肤，使眼球突出，将鼠倒置，用弯头小止血钳或镊子迅速摘除眼球并将眼球后包膜捅破，血液极快自眼眶流出或喷出，直至达到取血量，采血约1ml，静置，待血细胞凝固后，4000rpm/min低温离心10min，分离血清置于-80℃冻存待测。间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中IgG、IgG1及Ig2a抗体水平，具体为以50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔酶标板，抗原PsaA包被浓度为0.5µg/ml，包被体积为100µl，4℃包被过夜；弃抗原包被液，加入200µl 1×PBS-T20缓冲液(1×PBS，pH7.4，0.05%Tween-20)洗涤2～3遍；加入100µl封闭液(1%BSA，l×PBS-T20)，37℃封闭lhr；弃封闭液，加入200µl 1×PBS-T20缓冲液洗涤1～2遍；血清样品起始以1:100稀释于样品稀释液(0.5%BSA，l×PBS-T20)，然后2倍倍比稀释，各取100µl加入抗原包被过的酶标板中，每个样品均复孔加样，37℃反应2hr；弃样品液，加入200µl 1×PBS-T20缓冲液洗涤6～7遍；将HRP标记的羊抗小鼠IgG以l:5000，HRP标记的羊抗小鼠IgG1和IgG2a以1：10000稀释于样品稀释液，每孔各加入100µl用以检测血清的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，37℃反应lhr；弃酶联液，加入200µl 1×PBS-T20缓冲液洗涤6～7遍；每孔各加入100µlTMB底物溶液37℃反应20min；每孔各加入终止液浓硫酸100µl；将酶标板置于酶标仪中，于波长450nm测定吸光度值，记录每只小鼠血清的最大滴度水平，再取以10为底滴度倒数的对数代表抗体水平。眼球采血后颈部脱臼处死小鼠，按文献报道的方法[14]采集支气管肺泡灌洗液、鼻腔灌洗液以及中耳灌洗液，间接ELISA法检测灌洗液中特异性IgA抗体水平，方法同前，但BALF、NW、MEL均未稀释，最终以测得的450nm的吸光度OD值作为特异性IgA抗体水平。

BALB/c小鼠末次免疫后两周予氯胺酮（80mg/kg）/甲苯噻嗪（6mg/kg）腹腔注射轻度麻醉，在显微镜下用微量注射器经鼓膜前下方注射14型肺炎链球菌，每只耳5µl（1.6×107CFU）肺炎链球菌，对侧耳注射相同剂量的PBS，攻毒后小鼠于ABSL-2级实验室饲养，由专业人员饲全价配合饲料，自由饮水摄食，每日观察小鼠的精神状态、显微镜下观察小鼠的鼓膜情况。攻毒后5天完整取下小鼠的中耳听泡，多聚甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙两周，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红（HE）染色。以Image-Pro Plus 6.0软件分析单位面积（10000µm2）内中耳内炎症细胞的数目，每组10只动物，每只动物观察5张切片，每张切片随机选择5个视野，取均数作为该动物的代表值。

1.6 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件分析数据并作统计图。正态分布数据结果以x±SEM表示，单因素ANOVA进行统计分析后用Tukey检验进行组间比较；两组之间正态分布计量资料采用t检验分析差异；正态分布数据结果以柱形图表示；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清IgG、IgG1及Ig2a抗体水平检测

末次免疫后两周采集血清间接ELISA法检测PsaA特异性IgG抗体以及其亚型IgG1和Ig2a抗体水平；实验结果表明PsaA蛋白免疫组，PsaA/CTB免疫组在血清中均诱导了PsaA特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体产生,而CTB组无特异性抗体产生。PsaA/CTB组和PsaA组之间的抗体水平采用t检验分析差异，对于总IgG抗体水平，PsaA/CTB组明显高于PsaA蛋白组，差异有统计学意义（t=2.484 P=0.032）（表1、图1A），PsaA/CTB组的IgG1和IgG2a抗体水平也均高于PsaA蛋白组，差异均有统计学意义（t=3.690 P=0.004、t=2.577 P=0.028）（表1、图1B、图1C），本结果表明PsaA蛋白疫苗经鼻腔途径免疫可诱导产生全身免疫反应，在CTB黏膜佐剂的作用下全身免疫反应明显增强。

图1 血清IgG、IgG1及Ig2a特异性抗体水平分析(血清起始以1:100稀释，然后倍比稀释，纵坐标代表每组（n=6）平均抗体滴度±标准误，*代表PsaA/CTB免疫组与PsaA免疫组之间差异具有统计学意义，P＜0.05)Fig.1ELISA analysis of anti-PsaA total IgG(A)、IgG1(B)and IgG2a(C)antibody in serum.The serum was detected at 1:100 dilutions,then two-fold proportion dilutions.The data are presented mean antibody titre±standard error of six mice per group.Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.

2.2 黏膜灌洗液中IgA抗体水平

末次免疫后两周取支气管肺泡、鼻腔以及中耳灌洗液，间接ELISA检测PasA特异性IgA抗体水平,结果表明PsaA组、PsaA/CTB组BALF、NW及MEL均有较高水平黏膜特异性IgA抗体产生，而CTB组抗体水平较低,单因素ANOVA分析PsaA组、PsaA/CTB组与CTB三组之间抗体水平差异，结果表明不仅MEL中PasA特异性IgA抗体水平差异有统计学意义（F=135.1 P＜0.0001），而且BALF、NW中特异性IgA抗体水平差异也有统计学意义（F=165.9 P＜0.0001、F=110.1 P＜0.0001）（表2）。采用Tukey检验进一步比较PsaA组与PsaA/CTB组之间抗体水平的差异，结果表明PsaA/CTB组不仅中耳灌洗液中PasA特异性IgA抗体水平明显高于PsaA组，差异有统计学意义（P=0.017）（图2A），而且鼻腔和支气管肺泡灌洗液中的IgA抗体水平也明显高于PsaA组，差异具有统计学意义（P=0.015、P=0.003）（图2B、图2C）。

表1 血清PsaA特异性IgG、IgG1及Ig2a抗体水平Table 1Anti-PsaAtotal IgG、IgG1 and IgG2a antibody levels in serum

表2 黏膜PsaA特异性抗体IgA抗体水平Table 2Anti-PsaAIgAantibody levels in MEL、BALF and NW

图2 MEL、BALF、NW特异性IgA抗体水平分析(MEL、BALF、NW未稀释，纵坐标代表每组6只小鼠的OD450平均值±标准误，*代表PsaA/CTB免疫组与PsaA免疫组之间差异具有统计学意义,P＜0.05)Fig.2ELISA analysis of anti-PsaA IgA antibody in MEL（A）,BALF(B)and NW(C).The NW,MEL or BALF weredetected for IgA without dilutions.The data from NW,MEL or BALF are presented as mean OD450±standard error of six mice per group.Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.

2.3 疫苗接种对小鼠中耳炎症的影响

为观察CTB作为黏膜佐剂是否可以增强PsaA蛋白对急性中耳炎的免疫保护作用，末次免疫后两周经鼓膜途径注射14型肺炎链球菌，攻毒后5天进行中耳组织病理学检查。实验结果表明CTB组中耳腔有较多炎性渗出，中耳黏膜明显增厚，黏膜下炎性细胞增多，PsaA组中耳腔虽有渗出，但炎症细胞少，黏膜增厚程度较CTB组减轻，PsaA/CTB组中耳基本无渗出，黏膜虽有增厚，但炎症细胞明显减少，单因素ANOVA分析三组之间的中耳炎症细胞数差异有统计学意义（F=32.53P＜0.0001）。采用Tukey检验进一步比较PsaA组与PsaA/CTB组之间中耳炎症细胞数，结果示PsaA/CTB组炎症程度明显减轻，差异具有统计学意义（P=0.010）（图3）。

图3 中耳攻毒后炎症反应分析(HE染色；红色箭头示中耳黏膜×200；*代表PsaA免疫组与PsaA/CTB免疫组之间差异具有统计学意义,P＜0.05)Fig.3Analysis of inflammatory responses after middle ear challenge with pneumococcus.(H&E staining;red arrow represents middle ear mucosa;original magnification:×200;bar=100µm;Statistical difference between the group immunized with PsaA/CTB and that immunized with PsaA(P＜0.05)is marked with an asterisk.)

3 讨论

黏膜是肺炎链球菌进入机体的第一道屏障，黏膜免疫不同于全身免疫，黏膜免疫系统可以刺激产生局部黏膜免疫应答和全身免疫应答，黏膜免疫也是诱导局部产生长时期免疫记忆的最为有效途径，另外还可避免针剂的疼痛、减少注射局部的炎症反应、易于重复接种、可模拟病原体感染途径及可诱导局部IgA的生成和各种系统性B、T细胞效应等,这些优点使得黏膜免疫成为临床免疫研究关注的重要免疫途径。但是由于绝大多数黏膜免疫疫苗是非复制性抗原只有在大量和反复接种后才可引起免疫应答,而且黏膜吸收少，抗原性差，需要适合的黏膜免疫佐剂增强免疫应答。CTB已经被证实是强有力的黏膜免疫佐剂，可以增强黏膜免疫抗原的局部的抗体反应和免疫保护性。CTB发挥佐剂作用主要通过两方面，一是可以作为抗原分子的有效载体，促进抗原的吸收，更重要的是还可以上调抗原递呈细胞表面共刺激分子，从而增强抗原特异性T细胞和B细胞反应。因此，在本研究中采用CTB作为PsaA疫苗的黏膜佐剂。

急性中耳炎是通过黏膜途径引起的感染，黏膜免疫对急性中耳炎的预防更有效。目前已有的肺炎链球菌疫苗之所以对急性中耳炎的保护作用有限，原因之一可能是采用了非黏膜免疫途径，并不能产生局部黏膜免疫应答，而局部的分泌性IgA抗体对于黏膜感染有重要的保护作用[15]。正常中耳黏膜免疫活性细胞较少[16]，但是在急性或慢性炎症时可募集大量的T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫活性细胞至中耳黏膜[17]；在一项用血蓝蛋白免疫小鼠检测中耳黏膜免疫细胞清况的研究中发现中耳黏膜中有较多T辅助细胞、B细胞等[18]；Suenaga分析了正常小鼠的中耳黏膜，发现B细胞是中耳黏膜的主要淋巴细胞，而且在免疫后中耳黏膜淋巴细胞具有分泌特异性IgA的能力[19]；Kodama等对小鼠中耳黏膜、鼻黏膜及鼻相关淋巴组织（NALT）免疫细胞组成的分析研究发现：中耳黏膜和鼻黏膜不同于NALT，中耳和鼻腔黏膜就是黏膜免疫的效应部位，而NALT是免疫的诱发部位[20]。这些研究均表明中耳黏膜在适宜的抗原刺激后可产生免疫应答。我们的研究结果表明PsaA蛋白在CTB佐剂的作用下鼻腔免疫后不仅在鼻腔、支气管肺泡等常见黏膜部位产生了PsaA特异性IgA抗体，在中耳也产生了特异性IgA抗体，而且抗体水平明显高于PsaA组（P＜0.05），不仅证实了中耳黏膜在PsaA抗原的刺激下引起了特异性黏膜免疫应答反应，也证实CTB可增强PsaA的局部黏膜免疫反应。肺炎链球菌不仅是急性中耳炎的重要病原体，也是引起肺炎、脑膜炎、败血症等侵袭性疾病的重要病原体，因此对于肺炎链球菌疾病的预防不仅需要局部的黏膜免疫反应，也需要全身免疫应答。血清特异性IgG抗体与预防肺炎链球菌的侵袭性感染密切相关。在本研究中我们采用经鼻腔途径免疫，结果表明在CTB佐剂作用下血清中PsaA特异性IgG抗体以及其亚型IgG1和IgG2a抗体水平均较PsaA组明显增高（P＜0.05），证实了全身免疫应答反应的产生。

在本研究中我们证实了在CTB佐剂的作用下PsaA抗原通过黏膜途径免疫诱发了较高水平的系统和黏膜局部免疫反应，CTB增强了PsaA的免疫原性。为进一步评估疫苗预防中耳炎的有效性，本研究在疫苗免疫后两周，通过中耳鼓膜途径注射肺炎链球菌，因小鼠中耳容积仅5～6l，因此小鼠在麻醉后显微镜下注射5l体积的肺炎链球菌，实验中无一只小鼠死于麻醉及操作。肺炎链球菌急性中耳炎的诱发不仅与动物种类有关，还与细菌的血清型、数量及感染途径有关。肺炎链球菌有91种血清型，不同血清型的细菌致病力不同，有研究证实目前全球最常见的引起急性中耳炎的血清型是3,6A,6B,9V,14,19A,19F及23F[21]。本项实验中采用引起急性中耳炎常见的14型肺炎链球菌进行中耳攻毒，实验中无一只小鼠死于全身感染，小鼠均无菌血症发生。评价炎症程度最常用的指标之一是中耳浸润炎症细胞的数量。因此我们计算了不同免疫组小鼠中耳炎症细胞数，结果表明PsaA/CTB组的炎症细胞数明显少于PsaA组（P＜0.05），PsaA组的炎症细胞数明显少于CTB组（P＜0.05），提示PsaA/CTB组的炎症反应最轻，证实了PsaA经鼻腔途径免疫可以对急性中耳炎产生保护作用，CTB明显增强免疫保护性。

综上所述，本研究证实了CTB增强了PsaA蛋白的免疫原性以及对急性中耳炎的保护作用，是PsaA蛋白有效的黏膜免疫佐剂。鼻腔黏膜免疫可能是预防肺炎链球菌急性中耳炎的最佳免疫策略。

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Intranasal Immunization with PsaA/CTB Enhances Adaptive Immune Responses and Protection against PneumococcalAcute Otitis Media

Dai Wenjia,Liang Qiong,Liu Xiang,Li Wen,Xu Jianghong
Department of Otolaryngology,Eye Ear Nose&Throat Hospital of Fudan University,Shanghai 200031,China
Corresponding author:Xu JianghongEmail:15921826606@139.com

ObjectiveTo study specific immune responses and protective effects against pneumococcal acute otitis media in BALB/c mice immunized intranasally with PsaA protein vaccine and cholera toxin B(CTB)as a mucosal adjuvant.MethodsBALB/c mice aged 6 to 8 weeks old were randomly divided into 3 groups and were respectively immunized intranasally with PsaA protein(PsaA group,15µg PsaA protein),PsaA protein and CTB immunization(PsaA/CTB group,15µg PsaA/4µg CTB),or CTB(CTB group,4µg CTB)at the same dose two times weekly for three weeks.Two weeks after the last immunization,nasal lavage fluid(NW),middle ear lavage fluid(MEL)and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected for detection of specific IgA antibody.Serum was collected for detection of specific IgG,IgG1 and IgG2a antibodies.Mice were challenged with type 14 streptococcus pneumoniae by the tympanic membrane route.Middle ear inflammation was evaluated by histopathology 5 days after challenging.ResultsCompared to mice immunized with PsaA or CTB,anti-PsaA specific IgA in mucosal lavages were elevated significantly in mice immunized with PsaA/CTB(P＜0.05);and specific IgG,IgG1 and IgG2a antibody levels in serum with PsaA/CTB immunization were also significantly higher(P＜0.05).Significantly more inflammatory cells in the middle ear cavity were found in PsaA or CTB groups than in the PsaA/CTB group on day 5 after pneumococcal challenge(P＜0.05).Conclu-sionsMucosal immunization with PsaA/CTB is efficacious in generating mucosal and systemic immune responses and in protecting against acute otitis media.CTB is an effective mucosal immune adjuvant for PsaA.The study provides an experimental basis for designinh a new generation of pneumococcal vaccine.

Cholera toxin B;Streptocoocus pneumoniae;Mucosal immunity;PsaA;Acute otitis media

Conflicts of Interest:The authors have declared that no conflicts of interest exist.

R764

A

1672-2922（2017）05-561-6

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.012.

戴文佳，研究生，主治医师，研究方向:中耳炎黏膜免疫及机制研究

徐江红，Email:15921826606@139.com

Funding program:National Natural Science Foundation(No.81200736，No.81000406)

2017-03-14审核人：韩月臣）