一种芽孢杆菌的植物安全性评价

李卓+李莉玲+苗长春+梁子豪+郑文官+陈泽田+潘韵

摘要：指出了拮抗细菌B是实验室从种植小麦的土壤中分離和筛选出来的对小麦纹枯病菌具有良好拮抗作用的生物防治菌种，通过室内防效盆栽试验，证明了拮抗细菌B有很好的抵抗禾谷丝核菌的能力。同时根据形态学特征、生理生化特性测定和 16SrDNA序列分析将拮抗细菌B鉴定为枯草芽孢杆菌。试验采用拮抗细菌B的发酵液、三唑酮，多菌灵，井冈·蜡芽菌（井岗霉素蜡样芽孢杆菌）处理小麦种子，萌发后测量小麦的种子萌发率，小麦生长到一定时间后测株高及鲜重，从而评价了拮抗细菌发酵液的植物安全性。结果表明：拮抗细菌B发酵液对小麦种子的萌发和幼苗的生长具有促进作用。同时与市面上常用杀菌剂三唑酮等进行对比，分析了其对小麦萌发和生长改善的影响。探讨了验证拮抗细菌B的实际效用，以期为小麦纹枯病的有效防治和微生物生防杀菌剂的开发奠定基础。

关键词：禾谷丝核菌；拮抗细菌；生物防治；小麦；安全性评价

中图分类号：S435

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）23013904

1 引言

当下，并没有相应的小麦品种能有效的抵抗小麦纹枯病，在目前的生产中，对于该病主要是化学防治，目前防治小麦纹枯病较好的杀菌剂主要有井冈霉素、三唑酮、三唑醇、烯唑醇和纹霉净（复配剂）。一般采用2种药剂拌种处理和春季拔节期喷1次的防治方法。但是由于大量使用及使用的不合理，使小麦纹枯病菌对一些常用的化学杀菌剂产生抗药性，使药剂使用量越来越大，成本越来越高，效果很不理想，且使用化学试剂的残留物对环境和农产品造成污染产生危害[1]。因此，从小麦土壤中筛选有益的微生物，利用生物防治的方法进行防治成为当下研究的热点，但是，研究出来的成果表现出效果达不到预期效果和不稳定的特性，所以筛选出高效菌株同时提高菌株的稳定性成为当下研究的新目标。

目前已经发现的对小麦纹枯病菌具有较强抑制作用的生物防治菌株有放线菌 S024、B-3、蜡样芽孢杆菌 2011、2012、2013 和枯草芽孢杆菌 2014 等，使用这些菌株处理过的种子和植株后都能在植株体内定殖，并且能促进小麦植株的生长，提高品质及抗逆性。上海农乐生物制品有限公司将井岗霉素与蜡样芽孢杆菌混合研制出井冈·蜡芽菌，蜡质芽孢杆菌与井冈霉素经生物融合培养后，可以有效地防治作物真菌病害，既缓解了井冈霉素抗性，又提高了防治效果，同时还有增产作用，大大降低了农业成本[2]。

枯草芽孢杆菌拮抗植物病原菌的重要作用机理之一是与病原菌存在营养和空间位点的竞争。枯草芽孢杆菌可以在植物根际、 体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖，当枯草芽孢杆菌覆盖植物表面时会减少植物病原微生物与植物体的接触，有效的阻止和干扰了植物病原微生物在职务上的繁殖和感染，从而达到抑制病原菌生长，植物病发减少的效果[3，4]。

细菌在生长和繁殖的过程中会分泌出一些物质，这些物质能够促进细菌的生长和繁殖，同时这些物质也可以成为阻止其它细菌生长或者直接杀灭其它细菌的物质。枯草芽孢杆菌也不例外，枯草芽孢杆菌能产生枯草菌素（Subtilin）和枯草杆菌蛋白酶（Subtilosin），这两种细菌素属于抗菌肽类型，具有水溶性好、热稳定性强、分子量低、强碱性和广谱抗菌的特点。枯草芽孢杆菌产生的枯草菌素对致病菌等有很好的抗性，不仅在植物生防领域，在食品行业中也有很大用途：可以用作食品保鲜及食品防腐。这些新型抗菌物质的研究为抗菌基因，新型转基因抗病植物的研究奠定基础，提供理论指导。

2 研究目的及意义

枯草芽孢杆菌生长繁殖迅速，菌株对营养的要求比较单一简单，产生的芽孢能在高温下存活，抗逆性强，利于菌种的保藏和运输，又能忍受极端的外部环境而长期存活，可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，能与化学农药混用而不失活，在工业生产中：成本低、容易繁殖、生产工艺简单，这些都能使枯草芽孢杆菌成为一种非常好的生物生产药剂。美国己有 4 株枯草芽抱杆菌生防菌株 （ QST713、MB1600、GB03 和 FZB24） 得到了美国环保署 （ EPA） 商品化或有限商品化生产应用许可。在预防病菌的同时也成为植物增加产量产促进生长的药剂。

在国内也利用枯草芽孢杆菌防治植物病害，主要菌株有枯草芽孢杆菌B908，B3等。B908通过营养及与其他致病菌竞争生存空间的方式对那些容易被土壤中的病原菌侵害的农作物具有很好的抑菌作用，事实证明：B908对纹枯病的防治效果能达到70%。如果能更好的了解到枯草芽孢杆菌的一些生理特性及枯草芽孢杆菌对不同病原菌的抑制机理，就可以进一步的研制开发出新的配方，用枯草芽孢杆菌与其他菌种或者化学农药配合，生产出既能对植物病原菌产生拮抗作用，还能促进植物生长的复方农药。

本课题利用实验室分离鉴定出的对小麦纹枯病具有防止作用的枯草芽孢杆菌：拮抗细菌B，用其发酵液与一些常用杀菌剂进行室内盆栽防效试验，对拮抗细菌B对小麦生长的影响进行探究，为防治小麦纹枯病和枯草芽孢杆菌在植物生防方面的研究提供理论依据。

3 试验材料与方法

3.1 供试菌种与材料

供试菌株：拮抗细菌B（由实验室提取鉴定保藏的对小麦纹枯病具有拮抗作用的菌种）

小麦品种：郑麦9023（实验室保藏）。

对比药剂：三唑酮（成都科利隆生化有限公司）；多菌灵（上海沪禾科技发展有限公司）；井冈·蜡芽菌（上海农乐生物制品有限公司）。

3.2 试剂及仪器

3.2.1 试剂名称及生产厂家

试验试剂名称及生产厂家，如表1所示。

3.2.2 实验仪器

实验仪器的有关信息，如表2所示。

3.3 试验方法

3.3.1 培养基的配制

（1）LB固体养基的配制。成分：蛋白胨1 g、 酵母膏0.5 g、氯化钠1 g、蒸馏水100 mL 、1 mol/L NaOH溶液、pH值为7.0琼脂粉1.5 g。

①称量及溶化取所需要的烧杯至于电子秤上，去皮，按比例加入蛋白胨、氯化鈉和酵母膏（酵母膏为粘稠状固体，用玻璃棒挑取称量）。然后加入所需的水量的一半，放在电炉上加热搅拌，使试剂全部融化。

②调pH值。用1 mol/LNaOH溶液调pH值至7.0。

③定容。将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。

④加琼脂。加入培养基所需的琼脂的用量，在电炉上加热使琼脂融化，最后补充失去的水量使培养基达到所需要的体积。

⑤分装、加塞、包扎。

⑥高压蒸汽灭菌0.1 MPa灭菌20 min。

⑦在无菌操作台中倒平板。

（2）LB液体培养基的配制。成分：蛋白胨 1 g、酵母膏 0.5 g、氯化钠 1 g、蒸馏水 100 mL、1 mol/L NaOH溶液、pH值为7.0。

（3）细菌发酵液培养基的配制。成分：0.8%甘油、0.3%酵母膏、0.2%硫酸镁、0.2%磷酸氢二钾、蒸馏水 100 mL、pH值为6.8。

3.3.2 拮抗细菌B的活化

将双人双面超净工作台用75% 的酒精擦净，打开紫外灯照射30 min杀菌，用LB固体培养基倒平板，等到固体培养基冷却凝固后，用经过灭菌处理的接种环挑取一环待活化的拮抗细菌B在固体培养基上划线接种；然后将培养皿放入恒温培养箱中将温度调至28 ℃培养半天用以活化菌种。

3.3.3 拮抗细菌B发酵液的制备

在无菌操作台上，将拮抗细菌B各挑取一环接入装有20 mL LB液体培养基的100 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min条件下摇床培养12 h。按4% 的接种量，用移液管或移液枪吸取菌液4 mL接种到装有100 mL细菌发酵培养液的250 mL三角瓶，在28℃，180 r/min条件下，摇床培养48 h。经10000 r/min离心10 min后收集拮抗细菌B发酵上清液，4 ℃冰箱中保存备用。

3.3.4 拮抗细菌B发酵液的植物安全性分析

（1）小麦种子预处理。用水洗涤小麦种子两次，使小麦种子中的杂物洗掉；用3%的双氧水浸泡小麦种子10 min；用水把种子漂洗干净，然后用蒸馏水浸泡小麦种子24 h；把8～16层被水润湿的纱布平铺在磁盘中，然后把浸泡后的小麦种子均摊在纱布上置于阴暗处常温下保存，每天洒水于种子上使种子和纱布保持湿润。

（2）小麦种子的拌种处理。等到经预处理的小麦种子露白后挑取露白程度良好的种子500粒，均分为5组即每组100粒，分别置于5个小烧杯中，编号A B C D E；分别称取三唑酮0.0408 g、多菌灵0.0534 g 和井冈蜡0.402 g，再用蒸馏水分别稀释为100 mL，得到三种药剂稀释液，然后分别编号为a b c；分别用移液管吸取a b c三种稀释液10 mL分别置于A、B、C三个小烧杯中，同时分别移取10 mL的拮抗细菌B的发酵液，10 mL蒸馏水置于D、E烧杯中；再向A、B、C、D、E 5个小烧杯中分别加入1.224 g滑石粉并且用玻璃棒充分搅拌使6个烧杯中的物质混合均匀；将A、B、C、D、E 5个小烧杯中的小麦种子分别以每个烧杯对应5盆每盘20粒种植于编号为1～25的25个盛装有混合营养土的花盆中；然后把花盆置于有一定水深的盆子中，等待土壤全部浸湿后取出种植有小麦种子的花盆；处理组和对照组放在相同光照强度的室温环境中培养，每天光照和黑暗时间均为12 h，每天以每盆相同的水量洒水一次使土壤保存湿润。

（3）小麦种子萌发率的测定。待小麦种子萌发后分别测定每盆中萌发的小麦幼苗数并记录数据。

（4）小麦幼苗株高的测定。当小麦幼苗生长到一心一叶期后的第3 d分别用毫米刻度尺测定每盆中各株幼苗的株高并记录数据。

（5）小麦幼苗鲜重的测定。在测定株高后将所有的小麦幼苗连同根部拔出，用清水洗涤去除尘土，置于恒温干燥箱内烘干，然后称量每株幼苗的鲜重并记录所测得的数据。

4 结果与分析

4.1 不同处理结果对小麦种子萌发率的影响

不同处理结果对小麦种子萌发率的影响，如表3所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异不显著；若字母不同，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异显著（结果处理采用Duncan法）。

4.2 不同的处理对小麦幼苗株高的影响

不同的处理对小麦幼苗株高的影响，如表4所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异不显著；若字母不同，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异显著（结果处理采用Duncan法）。

4.3 不同的处理对小麦幼苗鲜重的影响

不同的处理对小麦幼苗鲜重的影响，如表5所示。

在上述表格中如果同列中具有相同的字母，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异不显著；若字母不同，说明该处理结果在0.05或0.01水平上差异显著（结果处理采用Duncan法）。

从上述的3个实验结果表格分析，用拮抗细菌B与对照组清水相比，拮抗细菌B对小麦种子萌发，小麦幼苗株高，小麦鲜重都具有明显的促进作用，达到了极显著水平差异。

与常用杀菌剂三唑酮对比，拮抗细菌B在对小麦种子的萌发和小麦幼苗鲜重的促进作用上与三唑酮近似，未达到显著水平，但是对小麦幼苗株高的促进作用上没有三唑酮效果好，达到了显著水平但未达到极显著水平。

与常用杀菌剂多菌灵对比，拮抗细菌B对小麦种子萌发的促进作用要好于多菌灵，达到了极显著水平，对小麦幼苗株高，鲜重的促进作用上与多菌灵近似，没有明显差别。

与混合杀菌剂井冈·蜡芽菌对比，拮抗细菌B在对小麦种子的萌发和小麦幼苗株高的促进作用上与井冈·蜡芽菌近似，没有明显差别，但是对于小麦鲜重的影响上拮抗细菌B要明显好于井冈·蜡芽菌，达到了极显著水平。

5 讨论

在本次实验研究中，利用同样的实验室土壤，在相同的环境下，用常用杀菌剂和空白对照表现出实验室菌株拮抗细菌B对小麦种子的萌发率及幼苗的生长具有促进作用。实验过程中，一共进行了两组实验，在第一次实验中，在拮抗细菌B发酵培养完后，并没有进行离心处理，在培养液中保留了拮抗细菌B，直接与处理过的小麦种子进行搅拌，在小麦培养过程中发现小麦种子的萌发率相对应的高些，但是生长状态却不如经过杀菌剂处理过的样品。在第二次实验中，严格按照实验流进行处理，过程中保持五组样品处理的高度一致性，处理数据得到表3、表4和表5。由上述表格中的数据可以看出，实验室所筛选出来的拮抗细菌B对小麦种子的萌发和幼苗的生长具有促进作用，虽然在某些方面不如化学杀菌剂，但是达到的总体效果令人满意。通过实验证明，拮抗细菌B在提高小麦种子萌发率、促进幼苗生长上比多菌灵，井冈·蜡芽菌要好，与三唑酮效果相当。实验中使用的土壤为实验室内土壤，但是没有经过灭菌处理，可能在这个方面会使实验结果产生一定的误差。有的菌株能够产生一些具有促进植物生长的生物质，这些生物质可以直接对植物的生长或者种子的萌发具有促进作用。从本次所做的两组实验的结果来看，不难分析出本实验室的拮抗细菌B自身对小麦没有明显的促进生长的作用，但是通过对拮抗细菌B进行发酵，发酵出来的细菌培养液对小麦种子的萌发和小麦幼苗的生长有很明显的促进作用。

基于这种结果，可以用拮抗细菌B发酵出来的细菌培养液与一些常见的农药如井冈霉素混合，用不同的配比制作出一些新型的复合农药，用于田间试验，一方面可以继续检测拮抗细菌B发酵出来的细菌发酵液对禾谷丝核菌的拮抗作用，另一方面也可以研发出新的农药，不仅对植物病原菌具有抗性，同时对植物种子的萌发和植株的生长具有促进作用。同时，运用单克隆，也可以批量生产拮抗细菌B，检测出拮抗细菌B对病原菌拮抗的有效成分。进而，可以从拮抗细菌B中提取出产生该种物质的遗传物质片段，进行质粒重组，嫁接到大肠杆菌等繁殖速度快的菌种中，进行工业化生产。

通过研究拮抗细菌B和D与市售杀菌剂对小麦种子萌发、株高及鲜重的影响，研究得出以下结论：① 对禾谷丝核菌具有拮抗作用的拮抗细菌B同时对小麦的生长有促进作用。②拮抗细菌B本身不能很好的促进小麦生长，而是其发酵产物能促进小麦生长。③与生物农药井冈·蜡芽菌相比，拮抗细菌B和D的发酵产物对小麦株高和鲜重的影响要好。

6 展望

在科技发展的今天，随着人们对农作物的培育，各种高产作物的出现使农作物病害成为减产的重要原因，一般来说，在农作物的种植上，都是采用喷洒农药的方式去消灭一些病虫害，但是对于由病菌引起的病害，只能通过加大相应农药用量或者增大种植空隙来消除或减轻。由于农作物面积广，大量的农药会流入土壤、地下水、河水等，不仅污染土壤河流，同时也会使水中的水产品，和土地中的农副产品相应的携带残留农药，农药的积累不仅会破坏生态平衡，而且会通过食物链的累积使人摄入，间接的危害到人们的健康。农药的过度使用也会使病菌产生抗药性，降低了农药的效果。我国耕地面积广泛，不同土壤中含有不同的微生物，从这些微生物中筛选出对某些病原菌具有拮抗作用的真菌細菌，用这些具有拮抗作用的真菌细菌制成农药防治农作物病害，不仅对新型生物农药的开发具有十分重要的作用，也对我国的农业具有重大意义。

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