基于粪便DNA的中缅树鼩性别鉴定

谌立新+梅丽+张海姬+侯东敏+朱万龙+王政昆

摘要：指出了SRY基因是存在于哺乳动物雄性Y 染色体上的性别决定基因，对该基因的检测可以快速准确地判定性别。利用分子粪便学方法从野外获取中缅树鼩粪便中提取到的基因组DNA，运用双重PCR同时扩增SRY基因和微卫星DNA后，经过电泳分析最终鉴定出了79只树鼩的性别。

关键词：中缅树鼩；粪便DNA；SRY基因；性别鉴定

中图分类号：Q943

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）22013103

1 引言

在地球上现存的动物中，凡是靠有性生殖来繁衍后代的种类，大多有雌雄个体之别。性别控制一直是人们所感兴趣的话题，在生物体内几乎都存在着性别决定系统，分化的雌雄两性无论在生理、行为、器官方面都存在显著差异，在某些低等的生物中还存在雌雄同体的情况，在某些物种中也有一些能进行孤雌生殖的物种仅仅只有一种性别的生物。性别决定是通过遗传和环境的作用使个体建立性别的过程，性染色体就是与性别分化直接相关的染色体[1]。动物的个体发育除了极低等的几种以外，多是从受精卵开始的，而性别决定与分化基本上是在胚胎时期就已完成，对于不同动物而言，其性别决定的影响因子也各不相同，因此，生物的性别决定一直在生物学中是令人感兴趣的研究领域，但决定性别分化的机制是比较复杂的，是由遗传、环境和生理因素相互作用的结果[2]。

1959年，Facobs提出哺乳动物的Y染色体在性别分化中起决定性作用[3]，于是许多科学家将目光聚集到雄性动物的Y染色体上，直至1990年，英国学者Sinclair在其研究中发现哺乳动物Y染色体的短臂边缘存在决定性别的片段即SRY基因。1991年，Koopman将含有SRY基因的Y染色体片段注入雌性小鼠胚胎中，最终导致了雌性小鼠生殖原基退化逐步发育为雄性，证明了SRY基作为哺乳动物的性别决定基因[4]。SRY基因被定义为Y染色体性别决定序列，广泛存在于哺乳动物包括有袋目动物雄性Y染色体上，但它在动物Y染色体上的位置、大小、结构都不尽相同。具有这种序列的染色体，在胚胎期能启动雄性激素的合成，进而促使性别朝雄性的方向分化，雄性的内外器官开始发育，精巢形成后，又能不断产生雄性激素，更进一步促使雄性内外器官的继续发育[5]。利用SRY基因的检测可以做到特异而快速地判定动物性别，正常情况下通过琼脂糖凝胶电泳观察，若为阳性（+）表明有SRY基因，则为雄性，反之则为雌性。

2 材料与方法

2.1 实验动物

中缅树鼩（Tupaia belangeri）属攀鼩目（Scandentia）树鼩科（Tupaiidae），是一种型似松鼠的小型哺乳动物，为东洋界特有类群，从马来西亚半岛北部一直到中国南部均有分布，在我国主要分布于云南、贵州、四川、西藏东南部、广西和海南等地[6]。中缅树鼩由于进化地位特殊，其系统分类地位一直备受争议，当前我国现生树仅有中缅树鼩一种。该动物常栖息于针阔混交林或阔叶林带，主要是稀树林缘灌木丛和次生林，在野外为杂食性动物[7]。由于在生理、生化方面与灵长类动物近似，加之生长繁殖周期短等已经成为生物医学领域中的重要新模式动物，目前中缅树鼩分类学、生理解剖学、寄生虫学、新陈代谢、病毒学和肿瘤学都已经进行过深入细致的研究。

2.2 样品采集

实验于2017年6～7月間在昆明市海口林场采样，采样地位于昆明市西山区海口镇北部，北纬24°47′～24°57′ ，东经102°26′～102°51′，该地区所处亚热带低纬高原山地季风气候，由于受到印度洋西南暖湿气流的影响，气候温暖干燥，无霜期为270 d以上，年均降雨量1450 mm，年平均气温15 ℃左右，该林场地理位置特殊，动植物资源丰富，分布着典型的亚热带常绿阔叶林，是中缅树鼩生活的较佳环境。在采集为了避免了样品污染，样品采集时，佩戴一次性手套，尽量采集有光泽的新鲜粪便，采集到的粪便样品立即装入自封袋，并注明采集地的生境特点、采集时间等，同时用GPS定位。

2.3 DNA的提取

本研究共3次采集，最后共获得103份中缅树鼩粪便样本。将样品存放于低温条件下并带回实验室-20 ℃保存，利用粪便DNA提取试剂盒QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取，具体步骤参照说明书。在操作前将粪便稍微放置-40 ℃超低温冰箱让其冰冻，尽量刮取粪便表皮部分提取中缅树鼩基因组DNA。由于采集时间在6、7月份，气温较高加之粪便中DNA含量较少，经过结合PCR扩增和反复提取后共79份粪便中次抽提合格的DNA样品。

2.4 PCR扩增目的片段

根据GenBank中缅树鼩SRY基因，利用Primer5.0软件设计引物，引物均由昆明硕阳科技有限公司合成（表1）。扩增中缅树鼩Y染色SRY基因片段，而微卫星DNA位点的RCR扩增进行提取的DNA检测，也是为了阴性对照，防止错误判别。PCR反应总体积为25 μL，10×Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL、20 μmol/L引物各1 μL、25 mmol/L MgCl2 1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、DNA模板1 μL，双蒸补加到25 μL。扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃预变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min（36个循环），72 ℃延伸5 min，4 ℃终止。

2.5 检测

以获得合格的DNA样品76份为模板进行微卫星DNA位点扩增，继而采用双重PCR同时扩增SRY基因和微卫星DNA位点，最后各取3μL扩增产物经过EB染色的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测观察。

3 结果与分析

从图1中可以看出，电泳结果显示DNA条带清晰明亮，PCR的结果较好，符合后续实验的使用要求，也从图中可以看出微卫星DNA TBC4位点扩增条带为130 bp左右。

琼脂糖凝胶电泳图2显示出条特异性扩增带，一条为130 bp左右，一条为600 bp左右，根据之前利用微卫星DNA检测中缅树鼩粪便DNA的结果再参照众多学者对林麝[8]、小麂[9]、绵羊[10]、牦牛[11]等动物的SRY基因研究，可以判定600 bp左右大小的条带为SRY基因扩增条带。同一泳道出现130 bp 和600 bp两条特异性扩增带判定为雄性，而泳道只出现一条130 bp条带可以判定为雌性，79只中缅树鼩中雌性有31只，雄性48只。

4 讨论

中缅树鼩DNA通过从粪便中提取出，利用的原理是野生动物的粪便中主要成分是一些未消化的食物残渣，而这些残渣在经过肠道时会粘附上大量的肠道上皮细胞，利用PCR技术的高倍扩增能力，可以从较少量的DNA中扩增出目的片段进行分析[12]。

20世纪90年代初期，粪便DNA技术建立之后就在动物生态学和保护遗传学中被广泛采用至今。但值得一提的是，粪便DNA的提取方法也不尽相同，当前国内外主要采用试剂盒提取（如美国Omega试剂，德国Qiangen试劑盒）、有机溶剂法、硫氰酸胍一二氧化硅法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法等几种方法。提取动物的DNA时，也根据采集粪便时的环境，粪便保存方法以及动物食性来加以选择和适当改进[13]。SRY基因鉴定性别已经广泛应用于临床诊断、产前诊断、法医鉴定。生物学方面常用于野生动物的研究，粪便DNA对于外部性别鉴定特征缺失、反应较敏捷、容易受惊吓的动物性别鉴定和其他研究提供了快速可靠的途径。

参考文献：

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Abstract： SYR gene is a sex-determining gene that exists in mammalian male Y chromosome. The detection of this gene can be done quickly and accurately. For this study， we obtained high quality fecal DNA from the stool of the tree shrews by molecular fecal methods. After simultaneous amplification of SRY gene and microsatellite DNA by double-PCR， the sex of the 77 tree shrews were identified by electrophoresis analysis.

Key words： Chinese-Burmese tree shrew； fecal DNA； SRY gene； sex identification