富含叶酸水稻研究进展

韩娟英 何曦 蒋宙蕾 梅沙 张宁* 吴殿星

（1 余姚市种子管理站，浙江余姚315400；2 浙江大学农业生物技术学院，杭州310058；第一作者：1293288389@qq.com；* 通讯作者：11216028@zju.edu.cn）

富含叶酸水稻研究进展

韩娟英1何曦2蒋宙蕾2梅沙2张宁2*吴殿星2

（1余姚市种子管理站，浙江余姚315400；2浙江大学农业生物技术学院，杭州310058；第一作者：1293288389@qq.com；*通讯作者：11216028@zju.edu.cn）

叶酸缺乏是世界性的公共健康问题，严重影响人类健康。水稻是世界第一大主粮，也是我国大部分人日常能量摄入的主要来源。但是水稻籽粒中叶酸含量极低，因此，通过提高水稻的叶酸含量将有助于解决我国以及全球许多以水稻为主粮的国家和地区的叶酸缺乏问题。本文介绍了叶酸的结构、在生物中的生理功能及叶酸缺乏带来的影响，阐述了叶酸在植物体内生物合成的途径，以及目前水稻叶酸强化的研究进展。

水稻；叶酸；叶酸代谢；生物强化

叶酸（Folates）系一种水溶性B族维生素，又称VB11或VB9，化学名蝶酰谷氨酸（Pteroylglutamic acid,PGA），是四氢叶酸（Tetrahydrofolate,THF）及其系列衍生物的总称。叶酸是生物体内转移甲基、甲酰基、甲烯基、次甲基以及羟甲基等“一碳基团”过程中的重要辅酶，在嘌呤、胸苷酸、DNA、氨基酸和蛋白质的生物合成与甲基循环等诸多反应中起关键作用。

叶酸是人体不可或缺的微营养，人体自身不能合成，只能通过膳食补充，缺乏可导致巨幼红细胞贫血、胎儿畸形、胎儿神经管发育缺陷、妊娠高血压综合症等生理代谢疾病。无论是发达国家还是发展中国家均存在叶酸摄入不足的情况，我国北方是叶酸重缺乏区[1]。

水稻是我国及世界重要的主粮，但其籽粒中的叶酸含量极低，无法满足人体的叶酸需求而易引起叶酸缺乏。目前，水稻叶酸的生物强化主要采取两种策略：通过加强叶酸合成通路中关键酶的表达量提高叶酸的绝对含量或通过叶酸结合蛋白（Folate binding protein,FBP）来提高叶酸的稳定性。

1 叶酸的生理功能

作为一碳单位转移酶系的辅酶，叶酸参与体内嘌呤和胸腺嘧啶的合成，参与氨基酸代谢、血红蛋白及肾上腺素、胆碱、肌酸等甲基化合物的合成，对细胞的分裂生长和核酸、氨基酸与蛋白质的合成起重要的作用。叶酸的缺乏使S-腺苷甲硫氨酸的合成受阻，导致胞嘧啶不能甲基化，从而造成全基因组甲基化程度低，最终导致原癌基因的激活和染色体的不稳定。同时，叶酸的缺乏还导致腺苷和嘌呤合成不足进而影响到DNA的修复。人体缺乏叶酸可导致血红球的异常、未成熟细胞的增加、贫血及白血球减少。据统计，全球由叶酸缺乏而引起的贫血高达30%，仅次于缺铁而导致的贫血[2]。

叶酸是胎儿发育不可缺少的营养素，对孕妇尤其重要。孕妇缺乏叶酸可能会导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等，且孕早期缺乏叶酸可以引起胎儿畸形、胎儿神经管缺陷而导致畸形。已有研究表明，叶酸摄入水平不足可以导致巨幼红细胞贫血、胎儿神经管缺陷、增加患心血管疾病和直肠癌等消化道癌症的风险，且低水平的叶酸摄入与老年痴呆症的发生密切相关[3-6]。神经管缺陷是一种常见的先天性畸形之一，由于在胚胎发育的第26～28 d神经管未闭合而造成的头部至脊柱部位从无脑到轻度脊柱裂等不同程度的畸形。全球每年约有25万新生儿患病，发病率达0.5‰～2.0‰。我国是神经管畸形的高发区，发病率约为2.74‰。Daly等[3]研究表明，在怀孕前每天服用 400 μg叶酸，可以降低70%的神经管缺陷的发生机率。Daly等[7]深入研究表明，如果坚持食用强化食物每天补充200 μg或100 μg叶酸，能预防几乎所有可用叶酸预防的神经管缺陷，而Scott等[8]认为最佳的情况是每天补充400 μg 叶酸。

叶酸缺乏能引起高同型半胱氨酸血症，从而增加患心血管病的风险[9-10]。越来越多的流行病学、实验和临床证据表明，人体内适宜的叶酸水平可以降低心血管疾病的发生，其作用机制包括3个方面：（1）充足的叶酸摄取能够增加血管内皮细胞NO的浓度，达到保护血管的作用；（2）叶酸具有预防高脂负荷诱导的高脂血症发生的作用；（3）叶酸缺乏会引起同型半胱氨酸水平的增加，体内叶酸的缺乏和高同型半胱氨酸血症会改变DNA合成和甲基化修饰，从而抑制血管内皮细胞的生长。

叶酸的缺乏还会导致阿尔茨海默病等神经退行性疾病，提高冠状动脉和心血管疾病的风险，同时也与一系列癌症如白血病、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺和支气管癌等有关[11]。

图1 植物体内叶酸的生物合成途径及转运步骤（引自Bekaert等[17]；Hanson and Gregory III[18]）

2 叶酸缺乏现状与强化措施

我国约20%的人叶酸摄入量不足，尤其是我国北方和西北部地区叶酸摄入量严重不足，每年约有1.8万幼儿患有神经管缺陷。Li等[12]调查发现，山西省的新生儿神经管缺陷发病率世界最高，部分年份高达14.9‰，其中60%是由叶酸缺乏引起。De Steur等[13]实行强化面粉项目的研究表明，山西省的神经管缺陷儿高发地区能够通过面粉强化达到降低和预防的效果。

随着人们认识的不断深化，在膳食中补充叶酸逐渐被重视。尽管许多食物中含有叶酸，但因叶酸对光和热具有不稳定性，容易失活，所以人体能从食物中真正获得的叶酸并不多。营养不良或一些吸收不良综合症，如胃切除术造成不充分吸收、因妊娠需求量的增加或因使用了一些干扰叶酸吸收的药物等，均可导致叶酸的缺乏。

采取在食品中添加人工合成叶酸和口服补充叶酸含片的措施，已成为改善人们叶酸摄入状况的有效方法。有研究表明，实行面粉强化叶酸规定后，神经管缺陷新生儿的发病率分别减少了26%、42%和40%[14-16]。但对居住在贫穷和偏远地区的发展中国家人群来说，该方法尚难以推广。

3 叶酸的生物合成及水稻中相关基因

3.1 叶酸的生物合成

叶酸分子结构由喋啶（Pteridine）、苯基甲酸（PABA）和谷氨酰胺（Glutamate）三部分组成，其生物合成途径较为保守，分别由叶酸的三部分合成并组装，见图1。各种生物的不同之处在于，细菌的叶酸合成过程发生在细胞质中，而植物中叶酸三个部分的合成分别发生于质体、线粒体和细胞质中。喋啶部分由质体中的三磷酸鸟苷（GTP）合成而来，PABA部分则由质体中分支酸盐转化而来。喋啶和PABA之后被转运至线粒体，被还原成单谷氨酸的四氢叶酸。在多聚谷氨酸酶的催化下四氢叶酸的谷氨酸γ位连上多个谷氨酸残基，成为具有多聚谷氨酸尾的叶酸。叶酸也分布于植物液泡中，培养基中的叶酸可直接被植物细胞吸收。叶酸的细胞膜间分布需要大量的转运过程，绝大多数的转运过程需要载体介导，而疏水性弱酸PABA可以通过扩散直接跨细胞膜进行转运。目前，唯一已知的植物叶酸转运载体位于质体上，因此至少还有3个叶酸转运载体（线粒体、液泡和质膜）和线粒体喋啶转运载体有待发现。转运载体的发现，有利于通过基因编辑技术从代谢途径层面提高叶酸的含量。

3.2 水稻中叶酸的生物合成途径相关基因

水稻的全基因组测序已在2002年完成，通过与已被鉴定的拟南芥等植物叶酸合成途径的各种酶的同源比对分析，水稻的整个叶酸合成过程中参与酶及其基因都已经清楚，汇总见表1。这些基因编码了GTPCHI、DHNA、ADCS、ADCL 等蛋白，分布在胞质、叶绿体、线粒体和液泡等不同细胞器中。水稻中的大多数叶酸合成酶的预测定位与拟南芥中的同源蛋白相同。首先在蝶啶合成途径中，水稻中有一个编码GTPCH1蛋白的基因位于第4染色体上，与拟南芥GTPCH1基因（AT3G07270）具66.2%的同源性，且都定位于细胞质中。与拟南芥一样，共有3个编码DHNA蛋白的基因在水稻中被发现，它们可能在不同的器官或组织、不同的发育阶段或是不同的环境条件下起作用。其次，在苯基甲酸合成途径中，编码ADCS和ADCL的基因在拟南芥和水稻中高度保守，定位于质体上，但是水稻中有2个编码ADCL的基因分别位于第2号和第5号染色体上，而拟南芥中只有1个。再次，在THF合成途径中，水稻中的HHPK/DHPS和DHFS分别由单个基因编码，且都含有线粒体信号肽，但拟南芥中分别有2个基因编码HHPK/DHPS和DHFS，且定位于胞质和线粒体中。拟南芥中分别有3个基因编码DHFP和FPGS，且定位于质体、线粒体和胞质中，而水稻分别有2个基因编码这2个酶，因为不含信号肽，都被预测定位于胞质中。最后，在叶酸的组装途径中，拟南芥中有3个编码GGH的基因，而水稻中仅有1个，但都定位于液泡中。叶酸的合成机制在植物中高度保守，对其中相关基因的深入研究将会为提高水稻中的叶酸含量提供更多理论基础。

表1 水稻中叶酸生物合成途径的相关基因

4 水稻中叶酸的生物强化

4.1 水稻中的叶酸含量

水稻中的叶酸含量极低且在储存过程中极易损耗[20]，蒸煮过程中也会损失26%[21]。即便是我国糙米中叶酸含量高达26.3 μg/100 g的水稻品种朝阳早18、特青、大白谷13和青丰矮，精加工中也会丧失95%，经蒸煮后又会进一步损失近50%，远远无法达到国际推荐成人每日叶酸摄入量（400 μg/日）。因此，十分必要通过水稻育种强化叶酸含量以缓解我国叶酸缺乏的现状。

Dieter等[22]分析检测了12个不同来源水稻品种的总叶酸含量，发现来自塞拉利昂的水稻品种Rok叶酸含量最低，为32 μg/100 g鲜质量；来自圭亚那的水稻品种Blue Belle叶酸含量最高，为68 μg/100 g鲜质量，其差异主要源于5-甲基四氢叶酸含量的差异。Dong等[23]分析检测了我国78份水稻种质资源的叶酸含量，发现糙米的叶酸含量存在8.4倍的变异，变异范围为13.3～111.4 μg/100 g，糙米平均叶酸含量为 48.8 μg/100 g；精米中平均叶酸含量为24.6 μg/100 g，其叶酸含量存在 7.6 倍的变异，变异范围为 10.3～77.7 μg/100 g；不同类型种质划分上，糙米中的叶酸含量籼稻比粳稻高32%，精米中籼稻比粳稻高24%。另外，稻米的蒸煮加工和储藏都会引起叶酸含量的降低，其中参试品种储藏2年引起的叶酸损失达19.9%～56.5%，平均每年的叶酸损失量为23.0%；蒸煮引起的叶酸损失为37.7%～68.9%，平均为48.3%。鉴于水稻品种间叶酸含量差异显著且变幅大，为此采用传统育种提高叶酸含量的空间较大。

表2 拟南芥和各种作物叶酸代谢基因工程汇总

4.2 转基因技术提高水稻中叶酸的含量

迄今为止，唯一提高叶酸含量的方法是转基因过表达叶酸合成过程中的酶。提高植物中叶酸的含量可通过过表达GTP环化水解酶I（GTPCHI）和氨基脱氧分支酸合成酶（ADCS）来实现。单独GTPCHI的过表达会引起蝶呤的大幅积累，单独ADCS的过表达会引起p-ABA的大幅提高，均不会引起叶酸含量的大幅变化，只有当两者共同过表达才表现出叶酸含量的大幅提高。叶酸代谢基因工程研究汇总结果见表2。

Storozhenk等[19]将拟南芥ADCS和GCHⅠ基因分别连接到水稻胚乳特异性启动子gluB1和glb-1下，使叶酸合成途径中的pABA和喋呤支路均得到加强，转基因水稻中叶酸的最高含量为1 723 μg/100 g，是野生型对照的100倍，也是迄今为止粮食作物中报道的叶酸最高含量，超过正常人群每日推荐摄取量400 μg的4倍多。提高的叶酸含量中，89%为5-甲基四氢叶酸，仅2.6%～14.0%为多谷氨酸化叶酸，而野生型中50%的叶酸为多谷氨酸化叶酸；喋啶和PABA含量分别提高4倍和25倍。在仅过表达GTPCHI的水稻株系中，未发现叶酸含量的提高，仅提高了25倍的喋啶含量；在仅过表达ADCS的水稻株系中，PABA含量提高了49倍同时提高了6倍的叶酸含量。在同时过表达GTPCHI和ADCS基因的水稻株系中，叶酸∶PBAB∶喋啶含量为1∶0.5∶0.013，说明在叶酸合成过程中，高 PABA 含量也是提高叶酸含量的制约因素。

Gillies等[27]将小麦HPPK/DHPS导入水稻，检测表明叶片中叶酸表达增加75%，籽粒中增加40%。董薇[31]研究发现，分别过表达 AtGTPCHI、AtADCS、AtDHFS 和AtFPGS基因可提高水稻籽粒中的叶酸含量。在过表达AtGTPCHI的转基因株系中，前后两代水稻的籽粒叶酸含量分别是野生型的3.7～6.1倍和3.3～3.7倍；在过表达AtADCS的转基因株系中，叶酸含量与野生型相比提高1.5～1.8倍。该研究结果与以往结果不同，可能是由于所用启动子序列不同。在过表达AtDHFS的转基因株系T1代中，叶酸含量提高14.5%～27.2%；在过表达AtFPGS的转基因株系T1代和T2代，分别比野生型叶酸含量增加7.5%～19.9%和4.3%～45.5%。然而，转AtDHNA和AtADCL的转基因株系的叶酸含量下降。Blancquaert等[33]分析了水稻籽粒发育过程中叶酸、PA－BA和蝶呤的积累情况，结果表明叶酸强化水稻籽粒中GTPCHI和ADCS基因的表达不会影响其他内源性叶酸的生物合成基因。

4.3 转基因提高水稻中叶酸的稳定性

叶酸结合蛋白对提高叶酸稳定性具有显著作用。在哺乳动物细胞中，已发现叶酸结合蛋白家族[34]。Jones和Nixon[35]在牛奶中发现了FBP。牛奶中所有的叶酸均与FBP结合。根据缓冲液体系和温度的不同，叶酸与FBP形成的化合物将极不稳定的四氢叶酸稳定性提高了2～1 000倍。在4℃、pH值为6.7时四氢叶酸与可溶性FBP结合后可稳定存在超过100 d，而对照组寿命小于1 h。目前的困境是尚未发现植物源的FBP。Goto等[36]通过过表达大豆储铁蛋白，大豆中铁含量提高2倍。因此，在水稻中转入FBP相关基因并过表达可能是提高水稻中叶酸稳定性的一种较为可行的方法。

5 结语和展望

水稻是我国约60%人口的主食。普通大米尤其是经蒸煮加工的大米叶酸含量很低，仅为3 μg/100 g，尽管通过添加人工合成的叶酸，采取食品强化叶酸增加叶酸摄入已证明是补充叶酸的有效措施，但是在偏远地区该措施很难付诸实践。培育高叶酸含量的水稻新品种，在叶酸缺乏地区推广不仅是源头膳食策略，也是更为经济可行的技术方案。

不同水稻种质资源的叶酸含量检测表明，水稻品种间叶酸含量差异显著且变幅大，这无疑为采用传统育种方法选育高叶酸水稻品种提供了巨大的空间和可能性。与此同时，采用转基因技术，已证明可以使稻米的叶酸含量提高20～100倍。在高叶酸水稻推广应用之前，有必要了解基因型、环境因素及其互作对水稻籽粒中叶酸积累的影响，并协同解决好高叶酸含量与稻米品质、产量和抗性的关系。

[1] Storozhenko S,De Brouwer V,Volckaert M,et al.Folate fortification of rice by metabolic engineering[J].Nat Biotechnol,2007,25:1 277-1 279.

[2] Kam K,Arcot J,Adesina AA.Folic acid fortification of parboiled rice:Multifactorial analysis and kineticinvestigation[J].J Food Eng,2012,108:238-243.

[3] Daly LE,Kirke PN,Molloy A,et al.Folate levels and neural tube defects[J].JAMA,1995,274:1 698-1 702.

[4] Ma J,Stampfer MJ,Giovannucci E,et al.Methylenetetrahydrofolatereductase polymorphism,dietary interactions,and risk of colorectal cancer[J].Cancer Res,1997,57:1 098-1 102.

[5] Stover PJ.Physiology of folate and vitamin B12 in health and disease[J].Nutr Rev,2004,62:S3-S12.

[6] Wang H,Odegaard A,Thyagarajan B,et al.Blood Folate is associated with asymptomatic or partially symptomatic Alzheimer's disease in the Nun study[J].J Alzheimer Dis,2012,28:637-645.

[7] Daly S,Mills JL,Molloy AM,et al.Minimum effective dose of folic acid for food fortification to prevent neural-tube defects[J].The Lancet,1997,350:1 666-1 669.

[8] Scott J,Kirke P,Molloy A,et al.The role of folate in the prevention of neural-tube defects[J].Proc Nutr Soc,1994,53:631.

[9] De Vriese AS,Blom HJ,Heil SG,et al.Endothelium-derived hyperpolarizing factor–mediated renal vasodilatory response is impaired during acute and chronic hyperhomocysteinemia[J].Circulation,2004,109:2 331-2 336.

[10] De Wals P,Tairou F,Van Allen MI,et al.Reduction in neural-tube defects after folic acid fortification in Canada[J].N Engl J Med,2007,357:135-142.

[11] 张永军.叶酸能够降低患阿尔茨海默病的危险 [J].中国保健食品，2006（3）:16.

[12] Li Z,Ren A,Liu J,et al.Maternal flu or fever,medication use,and neural tube defects:A population-based case-control study in Northern China[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol,2007,79:295-300.

[13] De Steur H,Gellynck X,Storozhenko S,et al.Health impact in China of folate-biofortifiedrice[J].Nat Biotechnol,2010,28:554-556.

[14] Williams LJ,Mai CT,Edmonds LD,et al.Prevalence of spina bifida and anencephaly during the transition to mandatory folic acid fortification in the United States[J].Teratology,2002,66:33-39.

[15] Hertrampf E,Cortés F.Folic acid fortification of wheat flour:Chile[J].Nutr Rev,2004,62:S44-S48.

[16] De Wals P,Tairou F,Van Allen MI,et al.Reduction in neural-tube defects after folic acid fortification in Canada[J].N Eng J Med,2007,357:135-142.

[17] Bekaert S,Storozhenko S,Mehrshahi P,et al.Folatebiofortification in food plants[J].Trend Plant Sci,2008,13:28-35.

[18] Hanson AD,Gregory III JF.Folate biosynthesis,turnover,and transport in plants[J].Annu Rev Plant Biol,2011,62:105-125.

[19] Storozhenko S,De Brouwer V,Volckaert M,et al.Folate fortification of rice by metabolic engineering[J].Nat Biotechnol,2007,25:1 277-1 279.

[20] Brouwer VD,Storozhenko S,Van De Steene JC,et al.Optimisation and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for folates in rice[J].J Chromatogr A,2008,1215:125-32.

[21] Blancquaert D,Storozhenko S,Loizeau K.Folates and folic acid:from fundamental research toward sustainable health[J].Crit Rev Plant Sci,2010,29（3）:14-35.

[22] Dong W,Cheng Z,Wang X,et al.Determination of folate content in rice germplasm （Oryza sativa L.）using tri-enzyme extraction andmicrobiological assays[J].Int J Food Sci Nutr,2011,62:537-543.

[23] Hanson AD,Gregory III JF.Synthesis and turnover of folates in plants[J].Curr Opin Plant Biol,2002,5:244-249.

[24] de la Garza RD,Quinlivan EP,et al.Folate biofortification in tomatoes by engineering the pteridine branch of folatesynthesis[J].Proc Nat Acad Sci USA,2004,101:13 720-13 725.

[25] Goyer A,Collakova E,de la Garza RD,et al.5-Formyltetrahydrofolate is an inhibitory but well tolerated metabolite in Arabidopsis leaves[J].J Biol Chem,2005,280:26 137-26 142.

[26] Bekaert S,Storozhenko S,Mehrshahi P,et al.Folate biofortification in food plants[J].Trends Plant Sci,2007,13:28-35.

[27] Gillies SA,McIntosh SR,Henry RJ.A cereal crop with enhanced folate:Rice transgenic for wheat HPPK/DHPS[J].Aust Cereal Chem Conference,2008.

[28] Naqvi S,Zhu C,Farre G,et al.Transgenic multivitamin corn through biofortification of endosperm with three vitamins representing three distinct metabolic pathways[J].Proc Nat Acad Sci USA,2009,106:7 762-7 767.

[29] Nunes AC,Kalkmann DC,Aragao FJ.Folate biofortification of lettuce by expression of a codon optimized chicken GTP cyclohydrolase I gene[J].Transgenic Res,2009,18:661-667.

[30] Akhtar TA,Orsomando G,Mehrshahi P,et al.Central role for gamma‐glutamyl hydrolases in plant folate homeostasis[J].Plant J,2009,2010,64:256-266.

[31] 董薇.水稻籽粒叶酸含量QTL分析及生物强化[D].北京：中国农业科学院，2011.

[32] 鹿晔，刘晓宁，姜凌，等.过表达蝶呤还原酶PTR1基因促进植物叶酸合成的研究[J].中国农业科技导报，2012，14（5）：49-56.

[33] Blancquaert D,Van Daele J,Storozhenko S,et al.Rice folate enhancement through metabolic engineering has an impact on rice seed metabolism,but does not affect the expression of the endogenous folate biosynthesis genes[J].Plant Mol Biol,2013,83（4）:329-349.

[34] Henderson G B.Folate-binding proteins[J].Annu Rev Nutr,1990,10（1）:319-335.

[35] Jones M L,Nixon P F.Tetrahydrofolates are greatly stabilized by binding to bovine milk folate-binding protein[J].J Nutr,2002,132:2 690-2 694.

[36] Goto F,Yoshihara T,Shigemoto N.Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene[J].Nat Biotechnol,1999,17（3）:282-286.

Progress on High Folate Content Rice

HAN Juanying1,HE Xi2,JIANG Zhoulei2,MEI Sha2,ZHANG Ning2*,WU Dianxing2
（1Yuyao Seed Administration Station,Yuyao,Zhejiang 315400,China;2College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou,310029,China;1st author:1293288389@qq.com;*Corresponding author:11216028@zju.edu.cn）

Folates deficiency is a global public health problem,has profound effects on human health.Rice is the most important staple crops in the world,and provides most population energy intake in China.Since rice seeds contain very little folates,enhancing folates content in rice would be a cost-effective way to solve folates deficiency in China and some countries and regions where the staple crop is rice.This review introduced the structure and physiological functions of folates,and the influences of folates deficiency.The biosynthetic pathway in plant and progress in folates-biofortification rice were also reported.

rice;folates;folate metabolism;biofortification

S511

A

1006-8082（2017）06-0007-06

2017－08－07

浙江省水稻育种（2016C2050-6）