去甲肾上腺素对原代培养大鼠心肌细胞的凋亡率及相关蛋白的影响

马艳霞,郭 政(山西医科大学麻醉学系,太原 03000;山西医科大学学报编辑部)

去甲肾上腺素对原代培养大鼠心肌细胞的凋亡率及相关蛋白的影响

马艳霞1,2,郭 政1
(1山西医科大学麻醉学系,太原 030001;2山西医科大学学报编辑部)

目的 观察去甲肾上腺素(NE)对体外培养的原代新生大鼠心肌细胞凋亡率及相关凋亡蛋白的影响。 方法 选用出生1-3 d的SD大鼠建立原代培养新生大鼠心肌细胞模型。将培养72 h的心肌细胞随机分为对照组(未使用任何药物)与不同浓度NE组(分别采用10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE),每组3孔(n=3)。加药后3 h采用流式细胞术测定心肌细胞凋亡率;采用Western blot检测CryAB及Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值的变化。 结果 与对照组比较,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE作用下心肌细胞凋亡率均出现显著升高(均P<0.05);CryAB表达下降(均P<0.05),Bcl-2表达下降(除10-8mol/L组外均P<0.05)、Bax表达升高(除10-7mol/L组外均P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05)。 结论 去甲肾上腺素可能通过降低CryAB、Bcl-2表达，升高Bax表达,降低Bcl-2/Bax比值，诱导体外原代培养大鼠心肌细胞的凋亡率增加。

凋亡; 心肌细胞; 去甲肾上腺素; αB晶体蛋白; Bcl-2; Bax

细胞凋亡广泛存在于生理和病理情况下,心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾病的病理过程均有心肌细胞凋亡的发生[1,2],但各种疾病状态下细胞凋亡的机制尚未完全阐明。细胞凋亡的过程受到多种因素的影响。作为交感神经的主要神经递质之一,去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)在生理浓度下的作用为正性变时、变力、变传导,但是其在病理情况下可以引起细胞凋亡[3,4]。因此,NE的作用可能与其浓度有关。

细胞凋亡的过程涉及因子众多,而因子间的相互作用决定了细胞最终是否发生凋亡。Bcl-2家族与热休克蛋白家族是细胞凋亡过程中发挥重要作用的两大家族。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比例与细胞是否发生凋亡关系密切[5,6],研究细胞凋亡时检测Bcl-2/Bax的比值变化至关重要。αB-晶状体蛋白(CryAB)在眼晶状体、心肌及骨骼肌等组织中均有丰富表达[7],其在成年心肌可溶性蛋白量中的比例占1%-3%[8],在心肌中具有重要的生理功能[9]。多项研究表明,CryAB与凋亡的关系密切[10-12]。但是NE与CryAB之间的关系尚不清楚。

为进一步阐明NE与心肌细胞凋亡及相关凋亡蛋白之间的关系,本研究采用体外原代培养的乳鼠心肌细胞模型,通过观察不同剂量去甲肾上腺素对心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其比值以及CryAB的影响,为探讨心肌细胞凋亡的可能机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选择出生1-3 d的SD大鼠,雌雄不拘,购自山西医科大学实验动物中心。去甲肾上腺素为上海禾丰制药有限公司产品;凋亡检测试剂盒及流式细胞仪为美国BD公司产品。DMEM培养液购自美国Gibco公司,无菌胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司。兔抗Bcl-2抗体、CryAB一抗均为美国Abcam公司产品。GAPDH、Bax一抗为美国Santa Cruz公司产品。

1.2 原代培养新生大鼠心肌细胞模型的制备

参照相关研究的原代细胞体外培养方法[13]制备新生大鼠心肌细胞模型。取出生1-3 d的SD大鼠,无菌操作取出心脏,以1 g/L的无菌胶原酶Ⅱ(质量/体积)消化后制成细胞悬液,在37 ℃、含5%CO2的培养箱中孵育70 min,计数后接种于6孔培养板。采用DMEM培养液孵育细胞。每24 h换液一次,待培育够72 h时选择生长状态及同步搏动良好的心肌细胞用于后续实验。

1.3 实验分组

取18孔培养72 h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)与终浓度为10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L的NE组,每组n=3。NE作用3 h,采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,采用Western blot的方法检测CryAB及Bcl-2、Bax表达及Bcl-2/Bax比值的变化。

1.4 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率

细胞凋亡率检测的操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。主要步骤:药物作用3 h,吸去上清,0.25%胰蛋白酶37 ℃作用3-5 min,终止消化并收集细胞,离心5 min(1 000 r/min),PBS洗涤,再次离心5 min(1 000 r/min)。重悬细胞。取100 μl细胞悬液,先后加入5 μl FITC与5 μl PI,混匀,室温避光孵育15 min。稀释至500 μl,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot的方法检测CryAB及Bcl-2、Bax的表达

采用Western blot的方法检测各组CryAB及Bcl-2、Bax的表达变化。主要操作步骤参考刘涛等[14]的方法并加以改进:提取总蛋白并采用BCA法进行蛋白浓度测定,据此计算上样量。电泳条件:浓度4%的积层胶60 V,浓度10%的分离胶150 V。采用PVDF膜进行蛋白转膜,CryAB一抗的浓度为1 ∶2 000,Bcl-2一抗,Bax一抗及GAPDH一抗的浓度均为1 ∶500。HRP二抗浓度为1 ∶1 500。ECL发光法显影并成像。采用Quantity One图像分析软件进行分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度NE作用3 h心肌细胞凋亡率的变化

与对照组比较,10-8-10-4mol/L NE组凋亡率均升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE组间两两比较,除10-8与10-4mol/L NE组间、10-7与10-6mol/L NE组间比较差异无统计学意义外,其余各组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05,见图1)。

与对照组比较，*P<0.05；与10-8mol/L NE组比较，#P<0.05；与10-7mol/L NE组比较，▽P<0.05；与10-6mol/L NE组比较，▼P<0.05；与10-5mol/L NE组比较，☆P<0.05图1 不同浓度NE作用3 h心肌细胞凋亡率的变化Figure 1 Changes of apoptosis of cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

2.2 NE对心肌细胞中CryAB的影响

10-8-10-4mol/L NE组心肌细胞中CryAB含量较对照组均下降,且差异有统计学意义(均P<0.05);但是不同浓度NE组间CryAB含量两两比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

图2 不同浓度NE作用3 h心肌细胞中CryAB的变化Figure 2 Changes of CryAB in cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

2.3 NE对心肌细胞中Bcl-2、Bax及其比值的影响

除10-7mol/L NE组外,与对照组比较，10-8,10-6,10-5,10-4mol/L NE组心肌细胞中Bcl-2含量均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);但10-8-10-4mol/L NE组组间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

除10-8mol/L NE组外,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE组Bax含量均升高,与对照组间的差异均有统计学意义(均P<0.05);不同浓度(10-8-10-4mol/L)NE组间两两比较,差异无统计学意义(均P>0.05，见图3)。

与对照组比较,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE组的Bcl-2/Bax比值均下降(均P<0.05),但不同浓度组间差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

3 讨论

3.1 去甲肾上腺素与心肌细胞凋亡

心脏接受包括交感神经在内的多重神经支配。急性心肌缺血、急性心肌梗死、急性心衰等心脏急性事件发生时,局部心肌收缩功能障碍,加上疼痛、焦虑等精神因素的作用,可以诱发心脏交感神经活性增强,产生儿茶酚胺类神经递质的浓度升高。去甲肾上腺素作为儿茶酚胺类神经递质,其在生理浓度下(约10-9mol/L)[15]的作用为使心率加快,心脏房室交界的传导加快,心肌收缩能力增强,每搏功增加。但病理状态下,大量NE合成、释放对心肌细胞具有直接和间接的毒性作用,甚至导致心肌细胞凋亡及致死性心律失常。

图3 不同浓度NE作用3 h心肌细胞Bcl-2、Bax及其比值的表达变化Figure 3 Changes of Bcl-2, Bax expression and Bcl-2/Bax in cardiomyocytes after treated with different concentrations of NE for 3 h

Communal等[16]于1998年首次应用成年大鼠心肌细胞培养模型,证实NE的毒性效应与心肌细胞凋亡有关。此后,陈吉等[3]、Shyu[4]等均采用不同方法研究证实,NE可以诱导心肌细胞的凋亡。但是不同研究者采用的NE的浓度及药物作用时间不同,且NE引起凋亡的机制尚未完全阐明。因此,本研究结合相关研究结果,选择10-8-10-4mol/L作为药物作用浓度,观察NE作用3 h对心肌细胞凋亡率的影响。结果表明,不同浓度NE(10-8-10-4mol/L)均能诱导体外培养的新生大鼠心肌细胞凋亡率的上升。

3.2 αB-晶状体蛋白与心肌细胞凋亡

αB-晶状体蛋白(CryAB)属于热休克蛋白家族的一员,其在心肌组织中含量丰富且具有重要的生理功能[9]。许多热休克蛋白可作用于凋亡信号通路的不同环节发挥抗凋亡作用。CryAB也可与多种细胞因子结合,通过多种途径发挥抗凋亡作用[[11,12,17]。本研究采用Western blot的方法研究NE诱导3 h后心肌细胞中CryAB的表达变化情况,结果表明,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L的NE作用3 h,均可引起心肌细胞CryAB蛋白的表达下降,不同浓度NE组间CryAB的表达差异无统计学意义(均P>0.05)。本研究结果与孙韬[18]的研究结果一致。因此高浓度的NE可以引起心肌细胞凋亡率增加,CryAB表达下降。结合CryAB的抗凋亡作用,我们推测,CryAB在拮抗NE引起的心肌细胞凋亡中发挥一定的作用,但是具体机制如何,还有待进一步研究。

3.3 Bcl-2家族与心肌细胞凋亡

Bcl-2家族成员众多,起抗凋亡作用的Bcl-2和促凋亡作用的Bax是其中两个最具代表性的成员。细胞凋亡的信号转导途径有多种,线粒体途径是其中最重要的途径之一[19]。Bcl-2家族成员能够通过调节线粒体膜上通透性转换孔(MPTP)的开启与关闭对细胞凋亡产生影响[19]。Bcl-2蛋白可以使MPTP的功能保持正常。而一些Bax蛋白在凋亡诱导因素作用下可与Bcl-2形成异源二聚体,抑制Bcl-2的活性,使MPTP不可逆开放,启动和维持细胞凋亡的线粒体途径。Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例以及它们之间相互作用形成同源或异源二聚体的倾向决定了细胞生存或死亡的命运[20]。因此检测Bcl-2与Bax的比值非常重要。本研究采用Western blot的方法研究心肌细胞中Bcl-2与Bax的表达情况,结果表明,不同浓度NE作用下均能诱导原代培养的心肌细胞中Bcl-2表达与Bcl-2/Bax比值下降,Bax表达升高,不同浓度NE之间蛋白表达量虽有波动,但是差异并无统计学意义。

Mao等[21]研究发现,人αB晶体蛋白可以通过与Bcl-2家族的相互作用起到抗凋亡作用。αB晶体蛋白可以与促凋亡因子结合,抑制Bax与Bcl-XS从胞质到线粒体的转位,保护线粒体的完整性,从而发挥抗凋亡的作用。结合本研究结果,我们推测,在高浓度的NE作用下,细胞凋亡程序开始启动,但同时也触发一些抗凋亡蛋白如CryAB的抗凋亡程序的启动。但是在高浓度NE作用下,CryAB始终处于低水平的表达状态,使得最终Bcl-2表达降低而Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降,促凋亡作用占优势,最终引起细胞凋亡。

本研究结果表明,不同浓度(10-8-10-4mol/L)的NE均可诱导体外原代培养的心肌细胞凋亡率升高,它可能通过抑制抗凋亡蛋白CryAB、Bcl-2表达,升高促凋亡蛋白Bax表达而实现。心肌细胞的凋亡过程涉及多种蛋白的参与,Bcl-2、Bax及CryAB都只是其中的一个因素,各个因素之间的共同作用以及优势蛋白的性质决定了细胞的最终结局,而各细胞因子之间的具体关系值得进一步深入探讨。

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Effectsofnorepinephrineonapoptosisofculturedratcardiomyocytesandexpressionofrelatedapoptoticproteins

MA Yanxia1,2,GUO Zheng1
(1DepartmentofAneasthesiology,ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001,China;2EditorialDepartmentofJournalofShanxiMedicalUniversity)

ObjectiveTo investigate the effects of norepinepherine(NE) on the apoptosis rate of cultured rat cardiomyocytes and the changes of the related apoptotic proteins.MethodsThe neonatal cardiomyocytes from the new-born Sprague-Dawley rats(1-3 days of age) were isolated and cultured. The cardiomyocytes incubated for 72 h were used for further experiments. Eighteen wells of the cultured cardiomyocytes were randomly divided into 6 groups(3 wells in each group): control group(without NE) and five NE groups(treated with 10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L NE respectively). The apoptosis rate of the cardiomyocytes were examined by flowcytometry(FCM). The expression of Bcl-2, Bax and αB-crystallin in cultured cardiomyocytes were detected by Western blot.ResultsThe apoptosis rate of the cardiomyocytes in NE graups(10-8-10-4mol/L)were significantly higher than that in control group(allP<0.05). The expressions of Bcl-2 and αB-crystallin were significantly decreased after treated with NE(P<0.05),while Bax was significantly increased(P<0.05),and the value of Bcl-2/Bax decreased significantly(P<0.05).ConclusionNE could induce the apoptosis by increasing the expression Bax,decreasing the level of Bcl-2, αB-crystallin and the ratio of Bcl-2 to Bax in cultured cardiomyocytes.

apoptosis; cardiomyocytes; norepinephrine; alpha B crystalline; Bcl-2; Bax

山西省青年科技研究基金资助项目(2015021183);山西医科大学博士启动基金资助项目(03201425)

马艳霞,女,1980-06生,博士,编辑

2017-10-15

R363

A

1007-6611(2017)12-1213-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.002