Th17/Treg细胞平衡在类风湿关节炎相关性肺间质疾病发病机制中的作用

李敏，郭毅飞，李雪锋，郑雪娜

(1.十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院内分泌风湿病科，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院附属人民医院血液内科，湖北 十堰 442000)

Th17/Treg细胞平衡在类风湿关节炎相关性肺间质疾病发病机制中的作用

李敏1，郭毅飞1，李雪锋1，郑雪娜2

(1.十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院内分泌风湿病科，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院附属人民医院血液内科，湖北 十堰 442000)

目的探讨辅助性T细胞17(Th17细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)平衡在类风湿关节炎(RA)及其相关性肺间质疾病(ILD)发病机制中可能的作用。方法纳入2015年10月至2016年10月在十堰市太和医院收治的42例RA患者(RA组)，38例合并肺间质疾病的RA患者(RA-ILD组)和40例健康者(对照组)作为研究对象；监测并记录所有患者RA 28关节疾病活动评分(DAS28)、类风湿因子(RF)、血沉(ESR)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)及肺功能等临床资料。采用流式细胞仪技术测定所有受试者外周血单个核细胞(PBMc)中Th17细胞和Treg细胞的比例，荧光定量PCR技术检测相应的转录因子维甲酸相关孤核受体(ROR-γt)和叉头螺旋翼状转录因子3(Foxp3)mRNA表达水平，并分析Th17/Treg细胞平衡与肺间质疾病的关系。统计学处理采用t检验和方差分析，相关性分析采用Pearson直线相关分析和Logistic回归分析。结果①在外周血中，RA-ILD组Th17细胞比例为(3.11±1.32)%，同RA组[(2.34±0.72)%]及对照组[(1.12±0.33)%]比较均有明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；RA-ILD组外周血Treg细胞比例为(3.53±0.84)%，RA组为(3.73±0.64)%，均较对照组[(5.83±1.55)%]明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但RA-ILD组与RA组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；RA-ILD组Th17/Treg细胞比例为(0.88±0.31)，较RA组(0.54±0.16)和对照组(0.38±0.11)显著增高，差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)；② RA-ILD组患者的ROR-γt mRNA表达水平为(13.12±3.73)，较RA组的(8.31±3.72)及对照组(4.12±1.22)显著升高，差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)，而RA-ILD组患者的Foxp3 mRNA表达水平为(1.24±0.55)，明显低于RA组的(2.53±1.14)和对照组的(3.74±1.25)，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；③Pearson直线相关分析显示，RA-ILD组患者的Th17细胞与Treg细胞比例呈负相关(r=-0.342，P=0.013)，ROR-γt mRNA与Foxp3 mRNA呈负相关(r=-0.413，P＜0.01)；④ Logistic回归分析显示，Th17细胞、Th17/Treg细胞比值、DAS28评分及病程对RA-ILD患者一氧化碳弥散量(DLCO)有显著影响(P＜0.05)。结论RA患者体内Th17细胞明显增多且伴随Treg细胞减少，Th17/Treg细胞比例失衡可能参与RA-ILD的发生及发展，并导致患者肺功能的恶化。

类风湿关节炎；肺间质病变；辅助性T细胞17；调节性T细胞

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因未明的，以对称性、侵袭性小关节滑膜炎症为主要特征的慢性、炎症性结缔组织病，患者除关节表现外，常伴有脏器损害，可引起较高病死率。有研究报道肺间质病变(interstitial lung disease，ILD)是RA患者最常见的关节外并发症，也是判断预后的重要因素及引起患者远期死亡的主要原因[1]。辅助性T细胞17(T help cell，Th17)是CD4+效应性T细胞亚群的重要组成成分，因其主要分泌IL-17而命名，它同时可分泌IL-6、IL-22等炎症细胞因子，介导机体炎症反应、自身免疫及移植排斥反应，维甲酸相关孤核受体(retinoid-related orphan receptor-γt，ROR-γt)是初始T细胞向Th17细胞分化非常重要的核转录因子[2]。调节性T细胞(T regulation cell，Treg)细胞也归属于CD4+效应性T细胞亚群，除高表达CD4外，细胞表面持续表达CD25分子，胞内高特异性表达叉头翼状螺旋转录因子P3(forkhead box P3，Foxp3)，Treg也在免疫调节中发挥重要作用。Th17/Treg细胞的平衡越来越受到研究界的关注和认可，这种平衡对维持正常免疫应答、防止自身免疫性疾病具有重要意义[3]。国内外已有较多研究表明RA活动期患者体内常伴随Th17细胞及Treg细胞数量及功能的改变，并与RA患者关节损害密切相关，但关于Th17/Treg细胞在RA-ILD中的作用罕有报道[4]。本研究通过检测RA-ILD患者外周血单个核细胞(PBMCs)中Th17细胞和Treg细胞的百分率及Th17/Treg细胞比值的变化，同时测定患者ROR-γt和Foxp3 mRNA表达水平，分析其与疾病活动度及肺功能的关系，探讨Th17/Treg细胞在RA-ILD发病过程中可能的病理生理学机制作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年10月至2016年10月在十堰市太和医院内分泌风湿病科门诊及住院的RA患者共80例，参照美国风湿病学会(ACR)2010年制定的RA分类标准纳入[5]。其中RA组42例，男性10例，女性32例；年龄22～58岁，平均(43.1±13.7)岁，平均病程(5.1±2.4)年。RA-ILD组38例，男性10例，女性28例；年龄20～57岁，平均(44.2±14.5)岁，平均病程(6.8±2.5)年。RA-ILD组患者均经肺部高分辨率CT(HRCT)确诊合并肺间质疾病，具体参照2002年美国胸科协会/欧洲呼吸协会(ATS/ERS)达成共识的RA并发肺间质病变的分类诊断标准[4]进行。所纳入病例均排除吸烟、高尘作业职业史、严重肺动脉高压、药物因素(使用金制剂及甲氨蝶呤者)、肥胖、合并严重肺部感染、肿瘤及严重心脏疾病患者。选择同期在十堰市太和医院健康体检中心经筛查的健康体检者共40例，其中男性10例，女性30例，年龄21～57岁，平均(41.8±15.2)岁。对照组均排除慢性心脏病、肾功能不全、慢性支气管炎、吸烟以及合并结缔组织病者，且血常规、血糖、肝肾功能、心电图、心脏彩超均正常。

1.2 临床及实验室检查及RA患者肺功能的测定 清晨采集肘静脉血，通过免疫比浊法测定类风湿因子(RF)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度；血沉(ESR)采用魏氏法测定。记录RA患者关节肿胀数、关节压痛数，根据RA患者28关节活动评分(DAS28)评分计算公式算出RA患者的DAS28评分值，评估疾病活动度。采用比利时Medisoft公司提供的肺功能仪评估，检测指标包括肺活量占预计值百分比(VC%)、用力肺活量占预计值百分比(FVC%)及一氧化碳弥散量(DLCO)。所有研究对象肺功能指标均由同1名经验丰富的呼吸内科医师进行检测，该医师对于所研究对象的临床资料不知情。

1.3 Th17和Treg细胞的流式细胞学检测 空腹抽取外周血3 mL，采用肝素钠抗凝。经Ficoll密度梯度离心法分离提取PBMCs，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，用含10%胎牛血清的RPM1640培养基重悬单个核细胞稀释，调整细胞密度为2×106个/mL左右。将样本的PBMCs分成两管，分别检测Th17细胞和调节性T细胞。其中一管PBMc加入PMA2.5 μL(终浓度50 ng/mL)和离子霉素2 μL(终浓度1 μg/mL)，放置于5%CO2细胞培养箱中进孵育3 h。孵育完成后，加入BFA 2 μL(终浓度10 μg/mL)进行阻断。2 h后收集细胞，各加入5 μL IFITC-CD3、FITC-CD4和藻红蛋白Cy5-CD8单克隆荧光抗体，4℃避光孵育30 min。加入PE标记的IL-17A单克隆抗体(FITC anti-IL-17A)，4℃避光20 min，PBS洗涤后，加入固定液100 μL，重悬细胞，规定时间内上流式细胞仪检测，CD3+CD4+IL-17A+表示为Th17细胞。取另一管样本100 μ L，PBS液洗涤后加入CD4-FITC 5 μL，CD25-藻红蛋白5 μL，CD127-多甲藻叶绿素蛋白-Cy5 5 μL。避光孵育30 min，PBS洗涤后加入固定液100 μL，重悬细胞，规定时间内上流式细胞仪检测，每份标本测定10 000个细胞，采用CD4+CD25+CD127low细胞表示Treg细胞。实验所用流式细胞仪为美国BD公司的Calibur型；抗人CD4单克隆抗体(APC anti-CD4)、抗人CD25单克隆抗体(APC anti-CD25)、抗人CD3单克隆抗体(APC anti-CD3)、抗人IL-17A单克隆抗体(FITC anti-IL-17A)、抗人CD127单克隆抗体(PE anti-CD127)均购自美国Biolegend公司。用Flowjo 7.6软件系统分析结果。

1.4 ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA的检测 采用RT-PCR法检测ROR-γt mRNA和Foxp3mRNA在PBMCs中的表达。空腹抽取静脉血3 mL置于EDTA抗凝管中，离心分离外周血，分离提取PBMCs，以PBS液洗涤后，取2×106细胞悬浮液置于1 mL Trizol的离心管中，采用Trizol法取外周血提取RNA后，采用吸光度吸光度(A)260/A280：为1.8～2.0用，反转录合成cDNA。以β-肌动蛋白基因β-actin作为内参照，相关基因引物由Primer Premier 5.0程序设计，如表1所示，引物的合成交由上海生物工程技术服务有限公司完成。反应条件为：95℃10 s，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。

表1 ROR-γt、Foxp3和内参β肌动蛋白基因引物序列

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示，两组间均数的比较采用独立样本t检验，三组间均数的比较采用单因素方差分析。变量的相关性分析采用Pearson相关性分析及Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RA-ILD组与RA组患者的临床资料比较RA-ILD组与RA组患者的年龄、RF、hs-CRP及ESR水平比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；RA-ILD组患者平均病程及疾病活动指标DAS28较RA组明显增高，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；RA-ILD组患者肺功能指标VC%，FVC%和DLCO%均较RA组显著下降，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.2 三组受检者外周血Th17细胞、Treg细胞/Th17/Treg细胞比例及ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA在PBMCs中的表达比较 RA-ILD组患者Th17细胞比例明显增高，与RA组及对照组比较差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)。RA-ILD组和RA组患者外周血Treg细胞比例均较对照组显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但RA-ILD组与RA组比较，Treg细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05)。RA-ILD组Th17/Treg细胞比例较RA组和对照组明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与RA组及对照组比较，RA-ILD组患者ROR-γt mRNA表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。RA-ILD组患者Foxp3 mRNA表达水平较RA组与对照组均明显降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

2.3 RA-ILD患者外周血Th17、Treg细胞、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平的相关性 对RA-ILD患者外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平进行Pearson直线相关分析，结果表明Th17细胞与Treg细胞比例呈负相关(r=-0.342，P=0.013)，ROR-γt mRNA 与Foxp3 mRNA水平呈负相关(r=-0.413，P＜0.01)。

2.4 RA-ILD患者肺功能与相应指标Logistic回归分析 分别以RA-ILD患者DLCO%作为模型因变量，以年龄、病程、ESR、hs-CRP、RF、Th17、Treg细胞比例、Th17/Treg细胞比值、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平为多因素的Logistic回归分析。结果表明，Th17细胞、Th17/Treg细胞比值、DAS28评分及病程是影响RA-ILD患者肺功能DLCO%的独立危险因素，见表4。

表2 RA-ILD组与RA组患者的临床资料比较(-x±s)

表3 三组受检者外周血Th17、Treg细胞、Th17/Treg细胞比例、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA比较(x-±s)

表4 影响RA-ILD患者DLCO的多因素Logsistic回归分析结果

3 讨 论

肺组织具有气体交换、免疫调节和内分泌功能，含丰富的血管、上皮细胞和胶原成分，常成为RA、系统性红斑狼疮(SLE)和原发性干燥综合征(pSS)及其他许多结缔组织疾病累及的靶器官[6]。ILD即发生在肺间质(包括支气管、血管周围、小叶间隔及肺泡间隔)的弥漫性病变，RA-ILD早期临床症状并不典型，多数患者晚期治疗效果较差，常容易合并肺部感染，并导致呼吸衰竭等并发症。RA-ILD发病机制尚未明确，多数研究认为ILD是免疫细胞、炎症细胞因子、炎性介质等因素通过多种生物学途径介导肺泡上皮细胞、肺成纤维细胞异常分泌及增殖，引起肺组织免疫损伤的结果，其最终的病理结局常表现为不可逆性肺间质纤维化，细胞免疫可能在RA-ILD发病机制中发挥关键作用，但相关研究却方兴未艾[7]。

人类CD4+的T淋巴细胞被划分成Thl细胞和Th2细胞两个亚群，各有其特定的细胞因子分泌，Th1/Th2免疫失衡在结缔组织病相关性ILD中的作用已得到了广泛研究。目前研究普遍认为Th1型细胞因子介导细胞免疫应答在结缔组织病相关性ILD炎症起始和激化阶段起关键作用作用，而Th2型细胞主要介导体液免疫，促进成纤维细胞增殖、胶原沉积和慢性纤维化，但Th1/Th2免疫失衡并不能解释RA-ILD的发病机制的全貌[8]。RA患者常存在Th1细胞功能和数量的改变，国外的研究发现CD4+T细胞功能缺陷与RA的发生及关节滑膜炎症损害的严重程度关系密切[9]。Th17细胞作为CD4+T细胞的一个新发现的亚群，因其在核转录因子ROR-γt的调控下，特异的高分泌炎症细胞因子，故它在RA发病中的作用要高于传统的Th1细胞，体内研究也证实Th1细胞在幼年特发性关节炎、血清阴性脊柱关节病、干燥综合征等多种结缔组织疾病发病中的重要作用[2]。Treg细胞可控制前炎性CD4+T细胞的稳态增殖，增加TGF-β、IL-4、IL-10等细胞因子分泌，对自身反应T细胞活化和增殖起负调控作用，Treg细胞数量或功能的改变对RA的发生及发展起关键作用[10]。Th17与Treg细胞在TGF-β、IL-6等多种细胞因子的诱导作用下相互遏制及转化，共同维持免疫平衡，Th17/Treg细胞比例失衡参与肺ILD的发生[11]。

本研究结果显示纳入的RA-ILD组患者炎症活动指标ESR，hs-CRP和RF水平与RA组患者类似，但患者平均病程较RA组长，DAS28积分较RA组患者增高，提示长病程和疾病活动参与RA患者ILD的发生。本研究提示RA-ILD组患者Th17细胞比例及其关键性核转录因子ROR-γt mRNA水平较RA组和健康对照组明显升高，而Treg细胞标志性核蛋白成分Foxp3 mRNA水平较RA组和健康对照组显著降低，RA患者体内Th17与Treg水平的变化与姚寿林等[12]的研究结果基本一致。此外，本研究提示RA-ILD组患者Th17/Treg细胞比例较RA组和对照组显著增高，相关性研究表明RA-ILD组中Th17细胞与Treg细胞比例呈负相关，ROR-γt mRNA与Foxp3 mRNA呈负相关，故推测RA-ILD患者Treg细胞数量和功能的降低无法抑制Th17等效应性T淋巴细胞的增殖及分化，促进患者炎症活动及ILD的发生。但本研究中RA-ILD组和RA组患者两组间外周血Treg细胞比例差异无统计学差异，此结果提示Treg细胞亚群失衡可能贯穿RA-ILD发病的全过程，本研究作为一个横断面的现况研究，尚不能完全反应Treg细胞比例及功能在RA-ILD发病机制中的所有作用，后续可能需扩大样本量进一步验证。

目前并无诊断RA-ILD特异性的实验室指标，早期主要依赖于高分辨率螺旋CT(HRCT)进行确诊，肺功能检查也是临床诊断和病情评估的重要检测手段。ILD患者肺功能主要表现肺泡弥散功能下降、限制性通气障碍，疾病早期首先表现为VC%和FVC%降低，后期可合并、进展为阻塞性通气障碍，严重时出现低氧血症，诱发呼吸衰竭，甚至危及患者生命。宋良月等[13]研究表明，高龄、长病程、关节炎性明显的RA患者易合并ILD，而且纤维蛋白原、C-胱抑素肽、血清白蛋白、外周血白细胞计数、中性粒细胞计数、α1-球蛋白、α2-球蛋白等临床指标的异常可能与RA患者ILD发生发展有关，可作为RA伴发ILD的预测因素。本研究结果提示RA-ILD组患者VC%、FVC%和DLCO%均较RA组明显下降，DLCO%的下降更为明显。DLCO占预计值%是评价ILD敏感的指标，能准确地反映ILD患者肺弥散功能的变化，常作为评估患者肺功能的良好指标[14]。本研究通过以DLCO%作为模型因变量的多元逐步回归分析提示，Th17细胞比例、Th17/Treg细胞比值、DAS28评分及病程均是影响RA-ILD患者肺功能恶化的独立危险因素，提示除吸烟、职业和药物等常见的危险因素外，患者病程、疾病活动度、Th17细胞及Th17/Treg细胞比例的变化均在RA-ILD发生、发展中起促进作用。Logstic回归模型中疾病活动指数DAS28是影响DLCO%的危险因素，但常见临床炎症指标如RSR、hs-CRP和RF等并未最终进入回归方程，分析原因可能与纳入病例多数处于活动期，单个炎症指标并不能完全反映出RA机体长期、慢性的炎症状态对肺功能影响的全貌[15]。

总之，RA-ILD的发生是一个原因复杂、多因素共同作用的结果，Th17细胞分化增多，Treg细胞功能缺陷以及Th17细胞/Treg细胞亚群比例失衡均可能参与RA-ILD的发病，并且与患者肺功能的恶化关系密切，后续需通过前瞻性的更大样本的临床研究提供更具说服力的判断。通过深入了解Th17/Treg细胞平衡在RA-ILD中的作用及作用机制可能对RA-ILD的早期发现及治疗具有重要意义。

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Role of Th17/Treg cell balance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease.

LI Min1,GUO Yi-fei1,LI Xue-feng1,ZHENG Xue-na2.1.Department of Endocrinology and Rheumatology,Taihe Hospital of Shiyan City,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.Department of Hematology Renmin Hospital Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the possible role of T help cell 17(Th17 cell)and T regulation cell(Treg cell)balance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA)and rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease(RA-ILD).MethodsFrom October 2015 to October 2016,42 patients with RA(RA group)and 38 patients with RA-ILD from Taihe Hospital of Shiyan City were enrolled,as well as 40 healthy controls(Control group).RA disease activity score in 28 joints(DAS28),rheumatoid factor(RF),blood Sedimentation(ESR),high sensitive-C reactive protein(hs-CRP),lung function and other clinical parameters were examined and recorded for patients with RA.Flow cytometry(FCM)was used for all subjects to analyze the ratio of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood mononuclear cell(PBMc),Real time quantitative polymerasechain reaction(RT-PCR)was used to analyze the expression of forkhead-winged-helix family transcription factor p3(Foxp3)and retinoid-related orphan nuclearγt(ROR)-γt mRNA in PBMc,and the relationship about Th17/Treg cell balance between ILD was also analyzed.T-test and Chi-square test were used for inter-group comparison.Pearson's linear analysis and logistic regression were used for correlation analysis.Results① The ratio of Th17 cells in peripheral blood of RA-ILD group was(3.11±1.32)%,which was significantly increased compared with(2.34±0.72)%in the RA group and(1.12±0.33)%in the control group(both P＜0.05);the ratio of Treg cells in the RA group was(3.73±0.64)%,and in the RA-ILD group was(3.53±0.84)%,both significantly decreased compared with(5.83±1.55)%in the control group.However,there was no significant difference between the RA-ILD group and the RA group(P＞0.05).The proportion of Th17/Treg cells in the RA-ILD group was(0.88±0.31),which was significantly increased compared with(0.54±0.16)in the RA group and(0.38±0.11)in the control group(both P＜0.05).② The expression of ROR-γt mRNA in the RA-ILD group was(13.12±3.73),which was significantly increased compared with(8.31±3.72)in the RA group and(4.12±1.22)in the control group(both P＜0.01),along with a decrease of Foxp3 mRNA expression in RA-ILD group(1.24±0.55)compared with the RA group(2.53±1.14)and the control group(3.74±1.25)(both P＜0.05).③ Pearson correlation analysis indicated that Th17 cells was negatively correlated with Treg cells(r=-0.342,P=0.013),and ROR-γt mRNA was negatively correlated with Foxp3 in RA-ILD group(r=-0.413,P＜0.01).④According to logistic regression analysis,the risk factors of carbon monoxide diffusing capacity(DLCO)in RA-ILD patients were the level of Th17 cells,the ratio of Th17/Treg,DAS28 and disease duration(all P＜0.01).ConclusionTh17 cell is increased while Treg cell is decreased in RA-ILD patients.The change of Th17/Treg cells ratio are important for the pathogenesis of RA-ILD and could aggravate the damage of lung function.

Rheumatoid arthritis(RA);Interstitial lung disease;T help cell 17(Th17);T regulation cell(Treg)

R593.22

A

1003—6350（2017）22—3630—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.005

国家自然科学基金面上项目（编号：81372998）

李雪锋。E-mail：ymclixf@163.com；郑雪娜。E-mail：zhengxuena1984@163.com

2017-05-22)

doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.006