慢病毒介导的靶向干扰MEX3A基因膀胱癌稳定细胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陈云云，黄瑛

（中国医科大学附属盛京医院超声科，沈阳 110004）

· 论著 ·

慢病毒介导的靶向干扰MEX3A基因膀胱癌稳定细胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陈云云，黄瑛

（中国医科大学附属盛京医院超声科，沈阳 110004）

目的构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体，建立稳定干扰MEX3A基因表达的膀胱癌细胞株。方法采用实时PCR检测膀胱癌细胞株中MEX3A基因的表达；应用GV115质粒构建重组靶向MEX3A基因的shRNA慢病毒载体，鉴定及测序合格后，与包装载体共转染293T细胞产生慢病毒颗粒，病毒滴度测定后转染膀胱癌细胞，经抗生素筛选建立稳定表达siRNA的细胞株，实时PCR检测敲减效率。结果MEX3A基因在膀胱癌5637和T24细胞中均有表达，且5637的表达量高于T24；鉴定及测序结果显示成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体，包装后病毒滴度较高，实时PCR结果表明慢病毒转染5637细胞后能稳定抑制MEX3A基因的表达。结论应用慢病毒介导的RNA干扰技术可成功建立稳定抑制MEX3A基因表达的细胞株。

MEX3A基因； 膀胱癌； 慢病毒； 细胞株

膀胱癌的发病率和死亡率均占泌尿系统肿瘤的首位，是十大常见肿瘤之一。2009年，我国肿瘤登记地区膀胱癌发病率为6.61/10万，其中男性发病率为9.78/10万，约为女性发病率的3倍［1］。膀胱癌具有治愈率低、复发率高、耐药性强、易转移的特点，患者的5年生存率仅为50%［2］。据文献［3］报道，低中级别膀胱癌患者术后1年复发率为20%～40%，高级别尿路上皮癌术后复发率可高达90%。膀胱癌的治疗方法主要有根治性膀胱切除、放射治疗、化疗、膀胱灌注等，但治疗效果和预后不甚理想［4］。

MEX3A基因是4种人类同源MEX3基因之一［5］，编码的蛋白参与RNA的代谢调节［6］。研究［5］显示，MEX3A蛋白与MEX3B是新发现的P小体的组成部分。P小体又称细胞质处理小体，是mRNA转录后调控过程中的一个重要场所，在基因表达过程中起至关重要的调控作用，主要参与mRNA降解、翻译抑制、mRNA监视以及RNA介导基因沉默等重要的生命活动过程［7-8］。研究［9］发现，MEX3蛋白中的环指结构域是泛素E3连接酶的特征结构域，推测MEX3蛋白可能通过泛素化作用参与了mRNA的降解。有文献［10］报道MEX3A基因与胃癌细胞的增殖、凋亡及转移有密切联系，癌组织中该基因的表达量远高于正常组织。目前，膀胱癌的具体发病机制尚未明确，因此，寻找一种新的相关靶基因将为膀胱癌的诊断、靶向药物治疗、预后评估提供新的思路。

本研究拟以MEX3A基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，构建目的基因RNA干扰慢病毒载体，包装完成后转染膀胱癌细胞，旨在建立能够稳定干扰MEX3A基因表达的细胞株。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌细胞株5637、T24（中国科学院上海生物所细胞库）；慢病毒载体及包装系统（GV115载体、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体）、293T细胞、感染增强液（ENi.S.）、polybrene、含无义shRNA序列及GFP标记的对照慢病毒（上海吉凯基因技术有限公司）；TOP10大肠杆菌感受态细胞、质粒提取试剂盒（EndoFree Maxi Plasmid Kit）、DNA凝胶回收试剂盒（TIANgel Midi Purification Kit） （北京TIANGEN公 司）；Age I、 EcoRⅠ、CutSmart Buffer9（美 国NEB公司）；T4 DNA Ligase （美国Fermentas公司）；Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司）；氨苄青霉素 （上海Genebase公司）；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Real-time PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）。

实时荧光定量PCR仪（lightcycler 480，瑞士罗氏公司）；荧光显微镜N-STORM（日本尼康公司）；数显式稳压电泳仪、 凝胶成像仪（上海天能公司）；分光光度计Nanodrop 2000（美国Thermo Scientific公司）。

MEX3A及GAPDH上下游引物由上海生工生物公司设计并合成，dsDNA oligo、鉴定引物（R&F）由捷瑞公司提供，DNA测序委托美季公司完成。

1.2 MEX3A-shRNA慢病毒载体的构建

1.2.1 RNA干扰靶点设计：根据RNA干扰序列设计原则，以GenBank中的MEX3A基因序列为模板，设计多个19～21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取合适序列作为干扰靶点，靶点序列为GCAAGGCTGCAAGATTAAG。

1.2.2 DNA oligo序列合成与制备：根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点。除此之外，在正义链3’端添加TTTTT终止信号，而反义链5’端添加终止信号互补序列（表1）。设计完成后，送捷瑞公司合成单链DNA oligo。将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中（终浓度20 μ mol/L），90 ℃水浴15 min。自然冷却至室温后，形成带黏性末端的双链。

1.2.3 线性化载体制备：按照NEB说明书配制50 μ L反应体系，使用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切GV115载体使其线性化。37 ℃（最适温度）反应1 h后，切胶回收目的片段。

表1 shRNA干扰序列Tab.1 The shRNA interference sequence

1.2.4 dsDNA oligo与线性化载体连接：按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20 μ L反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。于16 ℃反应1～3 h，之后行转化实验。

1.2.5 连接产物转化：将10 μ L连接产物加至100 μ L大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min；加入无抗生素的LB液体培养基，于37℃震荡培养1 h；取菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37 ℃培养箱中过夜培养。

1.2.6 阳性克隆的PCR鉴定与测序：配制20 μ L PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，循环22次；72 ℃ 5 min。鉴定引物-F序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATAPCR-3’，鉴定引物-R序列 ： 5’-GTAATACGGTTATCCACGC G-3’。结束后，取5 μ L产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。以鉴定引物-F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。

1.2.7 质粒提取：将测序正确的菌液转接于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，取样电泳，用分光光度计测定质粒浓度，将合格的质粒进行病毒包装。

1.3 慢病毒载体的包装及滴度测定

将提取的GV115质粒与pHelper1.0质粒、pHelper2.0质粒用脂质体瞬时转染包装细胞293T，于24 h和48 h收集病毒上清，观察细胞形态和GFP表达，将提取的病毒纯化和浓缩，采用梯度稀释法测定病毒滴度，将制备完成的病毒浓缩液分装于-80 ℃保存。

1.4 MEX3A基因在5637和T24细胞株中的表达

5637细胞和T24细胞均用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养。将2种细胞分别接种于6孔板中（2×105/孔）培养，1 d后收集细胞。提取总RNA，反转录获得cDNA，行实时PCR。MEX3A引物序列：5’-CGGAGTGGACTCTGG CTTTGAG-3’（上游引物），5’-CAGAGGAGAAGAGCA CGGAGGT-3’（下游引物）。以GAPDH基因为内参，PCR 引物序列 ： 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（上游引物） ， 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（下游引物）。PCR 反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环；65 ℃ 15 s。实时PCR采用Δ ΔCt法进行相对定量分析。选取目的基因表达量较高者进行慢病毒转染实验。

1.5 慢病毒转染及稳定表达MEX3A-shRNA的细胞株筛选

感染前1 d将细胞接种于6孔板中（2×105细胞/孔），培养24 h后加入病毒稀释液：实验组（shMEX3A组）加入含MEX3A-shRNA慢病毒的病毒稀释液，6.68 μ L/孔，病毒滴度为3×108TU/mL（ 预实验确定最佳感染复数为10）；对照组（shCtrl组）加入含阴性对照慢病毒的病毒稀释液（5.00 μ L/孔），病毒滴度为4×108TU/mL。培养12 h后更换培养基，继续培养72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。当转染效率≥70%时，加入含氨苄青霉素（2 μ g/mL）的培养基进行筛选。选用正常癌细胞作为对照，48 h后，可见阳性克隆，继续氨苄青霉素筛选2周，挑出单细胞克隆扩大培养即可获得稳定细胞株。

1.6 实时PCR检测MEX3A基因敲减效率

收集转染慢病毒的实验组和对照组细胞，按照1.4中的步骤进行操作。实时PCR采用Δ ΔCt法进行相对定量分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用t检验比较2组间差异，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。同一实验重复3次以上，取其平均值。

2 结果

2.1 MEX3A-shRNA慢病毒载体的鉴定及测序

dsDNA oligo与线性化载体连接后进行PCR扩增，扩增结束后凝胶电泳检测，结果（图1）显示，连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为341 bp，未连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为307 bp，与预期值相符。鉴定完成后，送交上海美季公司以鉴定引物-F进行阳性克隆测序，测序结果表明重组的慢病毒载体与参考序列相一致，说明合成的MEX3A-shRNA核苷酸序列插入正确，慢病毒载体构建成功。

图 1 重组MEX3A-shRNA慢病毒载体PCR电泳图Fig.1 Electrophoresis of the PCR products obtained from the recombinant lentiviral vector MEX3A-shRNA

2.2 慢病毒载体的包装及滴度测定

将慢病毒载体包装系统的3个质粒共转染293T细胞24 h后，显微镜下可见细胞生长良好，形态规则，细胞碎片少，继续培养72 h后荧光视野下细胞内有明显的绿色荧光，说明绿色荧光蛋白表达正常。将收集的病毒液纯化浓缩后，用梯度稀释法测定病毒滴度为2×109TU/mL，病毒包装成功。

2.3 MEX3A基因在膀胱癌细胞的表达

实时PCR检测显示MEX3A基因在人膀胱癌5637细胞株和T24细胞株中均有表达，且5637细胞的表达量高于T24细胞（图2），因此，选择5637细胞进行慢病毒转染和筛选。

图 2 MEX3A基因在膀胱癌细胞的表达Fig.2 Expression of MEX3A gene in bladder cancer cells

2.4 慢病毒转染5637细胞株及MEX3A基因的敲减效率

慢病毒转染5637细胞3 d后，荧光显微镜下观察发现细胞内可见明显的绿色荧光，荧光强度良好、均匀一致，与白光图谱对比显示，慢病毒的转染效率≥70%（图3）。实时PCR结果显示，与转染空载慢病毒的对照组（shCtrl）相比，实验组（shMEX3A）5637细胞中MEX3A mRNA的表达水平受到抑制，敲减效率达74%（图4）。

3 讨论

MEX3蛋白最早于1996年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）中被发现，该线虫中只含有1种MEX3同源蛋白，MEX3基因的突变会导致胚胎的前后不对称，从而使其死于囊胚期［11］。人类MEX3蛋白是一类在进化中高度保守的RNA结合蛋白，与秀丽隐杆线虫中的MEX3蛋白高度相似，但这4种蛋白在组织中分布并不一致，hMEX3D蛋白在全身的表达较为均一，而另外3种蛋白在不同组织的表达水平不同。4种MEX3蛋白都主要集中在细胞质内，并能通过CRM1通道在胞质与胞核之间穿梭［5］。有文献［12］报道hMEX3A和3B蛋白是2种新发现的P小体的组成部分，P小体是储存和降解mRNA的场所，聚集了大量无法进行翻译的mRNA链，而MEX3A和3B蛋白在P小体集中并能与hDcpla脱帽因子相互作用，由此可见MEX3同源基因参与了某些mRNA的调节。除此之外，MEX3A和3B蛋白也与Ago蛋白存在联系，Ago1和Ago2是RNA诱导沉默复合体的关键成分，这类蛋白已被证实参与了癌症的发生发展。然而，到目前为止MEX3蛋白在癌症中的作用仍然未知。

图 3 慢病毒转染后荧光图 ×100Fig.3 Fluorescence observed after lentiviral transfection ×100

图 4 实时PCR检测MEX3A基因mRNA的表达量Fig.4 Detection of MEX3A mRNA expression by real-time PCR

有研究者［10］通过RNAi技术沉默胃癌细胞的hMEX3A基因，发现癌细胞增殖明显受到抑制，且抑制作用主要出现于细胞分裂的G1/M期。同时，还发现hMEX3A基因沉默后，胃癌细胞在软琼脂的集落形成能力明显降低，提示hMEX3A基因参与了细胞转化。此外transwell chamber和wound healing assays检测显示，hMEX3A基因敲除显著影响了癌细胞的转移能力，临床相关分析显示癌组织的hMEX3A基因表达量显著高于正常组织，这些都表明MEX3A基因可能参与了癌症的发展与转化。尾型同源盒转录因子CDX2在肠细胞的正常发育以及癌化方面起至关重要的作用，但其调节机制非常复杂，PEREIRA等［13］研究发现MEX3A基因抑制了CDX2的表达，并由此介导了肠细胞的分化，说明该基因可能参与了癌症的转化。此外，KREPISCHI等［14］通过微阵列比较基因组杂交技术（Array-CGH）发现，MEX3A基因在肾母细胞瘤中呈过表达，提示MEX3A基因同样与泌尿系统肿瘤存在关联。

RNA干扰（RNAi）技术是近几年发展起来的一种基因阻断技术，其本质是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解，目前公认的作用机制为生物体内的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应［15］。本研究采用慢病毒载体进行RNA干扰，相对于其它载体，慢病毒具有转染效率高、安全性高、可感染非分裂期细胞的特点，但其最主要的优势在于能够将目的基因整合到宿主基因组，实现稳定转染，从而能进一步筛选出所需细胞株［16］。

本研究应用GV115质粒成功构建了针对MEX3A基因的shRNA慢病毒表达载体，PCR鉴定及测序结果均显示目的基因正确插入至质粒载体中，经包装后产生了较高滴度的病毒悬液。此外，还验证了MEX3A基因在膀胱癌细胞的表达，同时发现目的基因在5637细胞和T24细胞的表达量有较大差异，但造成这种差异的分子机制及其影响还有待进一步研究。本研究选取MEX3A基因表达量较高的5637细胞株进行慢病毒感染，荧光显微镜下可见转染效率较高，实时PCR结果也显示MEX3A的表达受到显著抑制，经抗生素筛选及培养后，获得了能稳定干扰MEX3A基因表达的细胞株，为进一步研究MEX3A基因对肿瘤细胞的影响及其作用机制奠定了实验基础。

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Establishment of a Bladder Cancer Cell Line with Stable Knockdown of MEX3A Gene via Lentiviral-mediated Interference

FANG Chao，YIN Jing，YU Qiushuang，CHEN Yunyun，HUANG Ying
（Department of Ultrasound，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo construct an shRNA lentiviral vector targeting the MEX3A gene and establish a bladder cancer cell line with stable MEX3A gene knockdown.MethodsReal-time PCR was performed to detect the MEX3A gene expression. The recombinant lentiviral vector targeting the MEX3A gene was constructed using the GV115 plasmid. After identification and sequencing，the vectors were co-transfected with the packaging vector into 293T cells to produce lentiviral particles，which were then transduced into bladder cancer cells after viral titer determination. The cell line stably expressing the siRNA was established by antibiotic selection，and real-time PCR was carried out to detect the efficiency of the knockdown.ResultsBoth bladder cancer cell lines，5637 and T24，expressed the MEX3A gene，and its expression was higher in 5637 than in T24. The identification and sequencing results showed that the MEX3A-shRNA lentiviral vector was successfully constructed，and the virus titer was observed to be higher after packaging. The results of the real-time PCR showed that MEX3A gene expression was stably inhibited in 5637 cells after lentiviral transduction.ConclusionLentivirus-mediated RNAi technology could successfully establish a cell line with stable MEX3A gene knockdown.

MEX3A gene； bladder cancer； lentivirus； cell line

R737.14

B

0258-4646（2017）12-1057-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.002.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.001

国家自然科学基金（81371552）

房超（1990-），男，硕士研究生.

黄瑛，E-mail：huangying712@163.com

2017-02-23

网络出版时间：2017-11-30 17:58

（编辑 王又冬）