响应面法优化酶法提取蜜环菌多肽及其抗疲劳活性

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(吉林医药学院药学院,吉林吉林 132013)

响应面法优化酶法提取蜜环菌多肽及其抗疲劳活性

于欢,李露,王思爽,马丽颖,刘秋爽,钟炳昌,张慧锋*

(吉林医药学院药学院,吉林吉林 132013)

以蜜环菌子实体为原料,采用酶解法制备蜜环菌多肽。在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,以水解度为响应值,研究底物浓度、加酶量、酶解时间、酶解温度对响应值的影响。通过游泳实验建立小鼠疲劳模型,考察蜜环菌多肽对小鼠游泳时间、肝糖原、肌糖原、尿素氮(BUN)、乳酸(LA)、乳酸脱氢酶(LDH)等指标的影响。结果表明:酶解法提取蜜环菌多肽的最佳工艺为:底物浓度7.4%,加酶量2%,酶解温度51 ℃,酶解时间4.6 h,水解度为35.61%,与理论值接近。以中剂量组为例,相对于空白组,蜜环菌多肽可以使小鼠肝糖原和肌糖原的含量分别提高109.01%和58.33%,显著降低代谢产物尿素氮水平36.99%、乳酸水平30.33%,乳酸脱氢酶的活性提高9%,以上数值p<0.05。综上蜜环菌多肽具有提高抗疲劳能力的作用。

蜜环菌,响应面,抗疲劳,多肽

蜜环菌[Armillariamellea(Vahl ex Fr)]属于担子菌亚门伞菌目白蘑料蜜环菌属,又名蜜环蕈榛蘑,是人们常食食用菌之一[1]。蜜环菌与中药天麻共生,是一种食药兼用真菌,其子实体味道鲜美,含有多种营养成分,并具有高蛋白低脂肪维生素含量丰富等特点。民间常用于预防视力失常、皮肤干燥、治疗癫痫、抵抗某些呼吸道和消化道疾病。现代研究表明,蜜环菌及其发酵产物有较多的药理作用,包括催眠镇静、调节血液循环、增强免疫能力、清除自由基、延缓衰老,抑制肿瘤等作用[2]。蜜环菌蛋白含量极高,对其蛋白降解产物的生理活性已经有了许多相关研究,但是对其可能的抗疲劳作用仍无相关研究,由此我们采用生物酶降解的手段制备蜜环菌多肽,并对其抗疲劳作用进行初步研究。酶解法制备活性肽具有反应条件温和,提取效率高的特点,而且这也是当前活性肽研究的热点。然而蛋白酶种类很多,水解能力各不相同[3-4],不同来源的蛋白酶酶解蛋白得到的肽的氨基酸残基组成也有不同,蛋白酶水解产物活性也不同。同时酶解效果受到多方面因素影响,因此制备高活性肽的关键是筛选出合适的蛋白酶以及酶解条件[5]。本实验以蜜环菌子实体为底物,以响应面法得到优化的酶解工艺,用耐力实验和生化指标检测[6]评价了蜜环菌多肽对小鼠的抗疲劳作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明种小鼠 体重20～22 g,许可证号 SCXK(吉)2016-0001,购于吉林大学(实验动物中心);蜜环菌子实体 由人工驯化的黄绿蜜环菌菌种 Armillaria luteo-rivens AM-H自行发酵得到;木瓜蛋白酶(800000 U/g)、菠萝蛋白酶(200000 U/g)、风味蛋白酶(200000 U/g)、碱性蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(60000 U/g) Sigma公司;乳酸测试盒、糖原测试盒、尿素氮测试盒、乳酸脱氢酶试剂盒、总蛋白测试盒 南京建成生物工程研究所;福林酚试剂、邻苯三酚、硫酸铵、硼酸、氢氧化钠、硫酸钾、盐酸 均为分析纯。

数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;pHS-3C数字酸度计 上海雷磁仪器厂;ML203电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MS300磁力搅拌器 上海般特仪器有限公司;MiniSpin plus离心机 Eppendorf 中国;mini1240分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜜环菌多肽提取液的制备 将干燥蜜环菌子实体粉碎后过40目筛,称取粉末5 g加入锥形瓶中,按照料液比1∶10的比例加入蒸馏水,0.1 mol/L NaOH或HCl溶液调节pH至酶解条件,加酶量800 U/g,恒温水浴酶解一定时间,100 ℃加热灭活10 min,5000 r/min离心分离上清,上清液0.1 mol/L NaOH或HCl溶液调整pH至中性,既得蜜环菌多肽提取液。

1.2.2 水解度的测定 蜜环菌水解度(DH)是水解过程中所断裂的肽键数占总肽键数的比例,通常表示为百分数的形式。按下式进行计算:

DH(%)=(水解后生成的α-氨基氮的量/样品总含氮量)×100

式(1)

甲醛滴定法[7]测得水解后生成的a-氨基氮的量,凯氏定氮法测得样品总含氮量,按照式(1)计算水解度。

1.2.3 蛋白酶的选择 将蜜环菌子实体分别用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶进行7 h酶解,按照文献记载条件[8]以1.2.1项下方法操作,以子实体水解度(DH)为考察指标,筛选出具有最优水解效果的一种酶。

1.2.4 酶解单因素实验设计 以水解度为考察指标[9],中性条件(pH6.8～7.8)下选择蜜环菌子实体浓度(2%、5%、8%、11%、14%,质量分数)、加酶量(600,1200,1800,2400,3000,3600 U/g)、水解时间(3、5、7、9、11 h)、酶解温度(35、45、55、65、75 ℃)4因素进行单因素实验。酶解初始条件蜜环菌子实体浓度5%,加酶量 1200 U/g,水解时间5 h,酶解温度45 ℃,控制变量法进行单因素条件筛选。

1.2.5 酶解条件响应面实验设计 根据单因素实验结果,以蜜环菌子实体水解度为响应值,结合Box-Behnken中心组合设计原理,选择底物浓度、加酶量、酶解温度和酶解时间,设计四因素三水平的响应面分析实验,共有27个实验点,实验因素及水平编码见表1。

表1 中心组合实验因素水平编码表Tabel 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.6 多肽抗疲劳能力研究

1.2.6.1 动物分组 适应喂养7 d后,120只小鼠随机分为4组,每组30只,分别进行脏器系数和负重游泳实验,糖原含量测定,血清尿素氮测定,乳酸含量和乳酸脱氢酶活力测定,其中每个实验组又分别为空白组(生理盐水)、低、中、高剂量组(灌胃给10、20、40 mg/kg/d蜜环菌多肽),阳性对照组(灌胃给予50 mg/kg/d牛磺酸),连续灌胃给药30 d,期间自由饮水和摄食。

1.2.6.2 小鼠体质量检测 小鼠适应性培养7 d后,按照动物分组,分别于灌胃前,灌胃15 d,灌胃30 d称量体重并记录[10]。

1.2.6.3 脏器系数 末次灌胃给药30 min后,强制小鼠连续游泳90 min,处死并分离脾脏、胸腺、肝、肾,生理盐水清洗滤纸吸干,分别称重,按照式(2)计算脏器系数[11]。

脏器系数=脏器绝对重量(mg)/体质量(g)

式(2)

1.2.6.4 小鼠负重游泳时间测定 末次灌胃给药30 min后,在小鼠尾部负体质量5%的铅丝,置25 ℃的水深30 cm水箱中进行游泳,记录小鼠从进入水中至游泳力竭头部完全没入水中不能上浮的时间。

1.2.6.5 肝糖原和肌糖原含量的测定 采用硫酸蒽酮法测定糖原,末次灌胃给药30 min后,小鼠不负重游泳90 min,解剖分离肝脏、肌肉,生理盐水洗去血液,滤纸吸干水分,称质量<100 mg样品。每百毫克样品加入100 μL碱液,沸水浴中水解20 min,流水立即冷却。水解液加蒸馏水制成1%肝糖原检测液和5%肌糖原检测液,按糖原测试盒说明书操作测定OD值,空白管调零,糖原含量按照式(3)计算。

糖原含量(mg/g)=测定管OD值/标准管OD值×0.01 mg×样本测试前稀释倍数×10/1.11

式(3)

1.2.6.6 尿素氮含量的测定 末次灌胃给药30 min后,小鼠不负重游泳90 min,静息60 min后摘除眼球取血,血样静置1 h,3000 r/min离心15 min取上清,分别测定游泳后和游泳前血清尿素氮含量。按尿素氮测试盒说明书操作测定尿素氮含量,按式(4)计算。

尿素氮含量(mmol/L)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10 mmol/L)×样品稀释倍数

式(4)

1.2.6.7 乳酸含量测定 末次灌胃给药30 min后,各组分别在安静时及负重体重5%游泳30 min后的0,20 min摘除眼球取血,制备血清,按乳酸测试盒说明书操作测定各管OD值,乳酸含量按式(5)计算。

乳酸含量(mmol/L)=(样品管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度(3 mmol/L)×测定样本稀释倍数

式(5)

1.2.6.8 乳酸脱氢酶活性测定 末次灌胃给药30 min后,各组分别在小鼠安静时及负重体重5%游泳20 min后立即摘除眼球取血,制备血清。按乳酸脱氢酶试剂盒说明书操作,混匀,室温放置5 min,于酶标仪上450 nm处测定各管吸光度,按式(6)计算LDH活力。

计算公式:血清中LDH活力(U/L)=(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准品浓度(0.2μmol/mL)×1000

式(6)

1.3 数据统计分析

酶解工艺优化实验数据采用Design-Expert8.0.6软件进行二次回归分析及方差分析,抗疲劳活性采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

从图1中可以看出在各自适宜条件下中性蛋白酶对蜜环菌子实体的水解程度最高,这可能是由于蛋白酶对底物水解的选择性所导致[8],故选择中性蛋白酶作为酶解蛋白,在下面的实验中以水解度为响应值优化酶解条件。

图1 不同蛋白酶的水解效果Fig.1 Effect of different protease on hydrolysis

2.2 酶解单因素实验结果

2.2.1 底物浓度对水解度的影响 由图2可知,水解度随底物浓度的升高呈现先升高随后趋于平缓略有下降的过程,当底物浓度为8%时水解效果较好。这可能是由于在一个酶催化反应中,当底物浓度较低时,蜜环菌子实体与蛋白酶的接触不充分,随着底物浓度的增加,可以与蛋白酶接触的底物量也随之增大,水解反应也更充分。当底物浓度过高时,蛋白酶被饱和,同时导致蛋白酶的浓度相对下降减少了底物与蛋白酶的接触,使水解度表现为略有降低[12]。

图2 底物浓度对水解度的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis

2.2.2 加酶量对水解度的影响 由图3可知水解度随加酶量加大而增大,达到1200 U/g以上时,变化平缓。这是由于在底物的量是有限的情况下,适量的增加酶量能够促进酶解反应的进行,但当酶量达到饱和时,多余的酶不参加催化反应,所以水解度不再上升[13]。

图3 加酶量对水解度影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis

2.2.3 水解时间对水解度的影响 由图4可知水解度随水解时间延长而增大,随着时间的延长水解度增大的趋势随之减缓直至基本不再升高,这是由于随反应时间延长,体系中反应产物逐渐累积直至抑制反应的进一步进行。

图4 水解时间对水解度影响Fig.4 Effect of different time on hydrolysis

2.2.4 水解温度对水解度的影响 如图5所示,在适当温度范围内,升温可以促进反应体系中分子的运动增加分子间碰撞的机率,表现为酶促反应水平的升高,但是蛋白酶本质上是一种蛋白质,温度过高会破坏蛋白结构进而失活,表现为水解度的下降[14]。

图5 水解温度对水解度影响Fig.5 Effect of different temperature on hydrolysis

2.3 响应面实验设计结果

Box-Behnken实验结果如表2,采用Design Expert 8.05b对结果进行二次回归多项拟合。

表2 响应面实验方案结果Table 2 Response surface experimental design and test results

4因素对蜜环菌子实体水解度回归方程为:

Y=+35.04-1.91×A+1.79×B+4.32×C-1.28×D+1.19×A×B+1.57×A×C+2.26×A×D-2.59×B×C-1.93×B×D-1.52×C×D-4.96×A2-4.67×B2-13.78×C2-5.98×D2(R2=0.9619)

回归模型显著度高(p<0.01),失拟项不显著(p>0.05),相关系数R=0.9619,说明回归方程拟合度和可信度适当[15]。由表3的模型分析可知,酶解温度对水解度的影响最为显著,其次是底物浓度,加酶量,酶解时间对于水解度影响不显著。

表3 回归模型方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

2.4 各因素交互作用的响应面分析

响应面是响应值对实验因子所构成的三维空间的曲面图,各个参数之间的相互作用可以从响应面上得到直观地体现。由图6可知,实验得到的响应面为一开口向下的曲面,响应值所因素水平的升高而升高,当响应值达到最高点后,响应值随因素水平的升高而下降。

图6 四因素对水解度的响应曲面图Fig.6 Response surface of four factors on hydrolysis

2.5 回归模型验证

模型预测底物浓度7.42%,加酶量1300.08 U/g,酶解温度51.40 ℃,酶解时间4.62 h,水解度达到最高为35.79%。实际操作中选择底物浓度7.4%,加酶量1300 U/g,酶解温度51 ℃,酶解时间4.6 h;经模型预测水解度为35.8%,平行进行三次验证实验,水解度平均值为35.61%,与预测值吻合。

2.6 多肽抗疲劳能力研究结果

2.6.1 对小鼠体质量的影响 由表4的实验结果可见,随培养时间延长,各种小鼠的体重均呈现上升趋势,然而各组之间差异不显著(p>0.05),表明给予蜜环菌多肽对于小鼠的体重没有显著性影响。

表4 蜜环菌多肽肽对小鼠体质量的影响Table 4 Effects of ALP on weight of mice

2.6.2 对小鼠脏器指数的影响 由表5可知,蜜环菌多肽对小鼠脾脏和胸腺指数有一定影响,低、中、高剂量组间差异不显著(p>0.05),胸腺指数中、高剂量组与空白组差异显著(p<0.05)。对于肝脏和肾脏指数无显著影响(p>0.05),胸腺和脾脏作为免疫器官,蜜环菌多肽对两者系数的提高,表明其有增强非特异性免疫功能的作用[16]。

2.6.3 对小鼠负重游泳时间的影响 空白组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠负重游泳时间分别为85±3.51,117±4.29,102±3.46,129±5.16,146±4.72 min,蜜环菌多肽组小鼠负重游泳时间显著延长,与空白组相对比差异显著(p<0.05)。游泳实验是观察动物抗疲劳能力的重要指标,机体的运动耐力可以被负重游泳时间直接反映,蜜环菌多肽组可以显著延长负重游泳时间,延长比率与剂量呈正相关,所以蜜环菌多肽提高了小鼠的运动耐力。

表5 蜜环菌多肽对小鼠脏器指数的影响Table 5 Effects of ALP on viscera indices of mice

注:*表示与空白组差异显著(p<0.05),**表示与空白组差异极显著(p<0.01)；表6～表9同。

2.6.4 对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响 由表6可知,蜜环菌多肽对小鼠肝糖原和肌糖原都有显著升高的效果,中、高剂量组相对于空白组含量升高显著(p<0.05),低剂量组与阳性对照组差异不显著(p>0.05),对糖原的升高效果呈现剂量依赖性。糖以肝糖原和肌糖原两种形式在机体内贮存,是糖代谢过程中重要能源物质形式。贮存的肝糖原和肌糖原提供运动所需能量,维持运动时的血糖水平,延缓疲劳,糖原可以作为评价疲劳的指标[17]。实验结果表明在连续灌胃给予蜜环菌多肽后,机体对糖原贮备能力提高,同时在运动过程中对糖原的消耗也有所下降,从而提高糖原的利用效率,延缓疲劳的产生。

表6 蜜环菌多肽对小鼠肝糖原和肌糖原的影响(mg/g)Table 6 Effects of ALP on liver glycogen and muscle glycogen of mice(mg/g)

2.6.5 对小鼠尿素氮含量的影响 由表7可知,小鼠强制游泳后血清尿素氮的含量明显上升,阳性对照组和蜜环菌多肽组尿素氮含量均低于空白组,低、中、高剂量组与空白组差异显著(p<0.05),蜜环菌多肽对于降低小鼠血清尿素氮含量的作用呈现剂量依赖性。小鼠长时间游泳后,糖代谢和脂肪分解代谢将不能提供足够的能量维持运动所需,此时蛋白质和氨基酸会参与分解代谢提供能量,此外,核苷酸代谢随之加强,这些代谢途径都会产生氨通过尿素循环转变为尿素,因此血清中尿素氮的含量会随之上升。故而尿素氮反映整体蛋白质的代谢情况,蜜环菌多肽可能通过降低运动后血清尿素氮的生成,延缓疲劳的产生[18]。

表7 蜜环菌多肽对小鼠尿素氮含量的影响(mmol/L)Table 7 Effects of ALP on BUN of mice(mmol/L)

2.6.6 对小鼠乳酸含量的影响 由表8可知,在游泳之后小鼠血清中乳酸含量都有所升高,阳性对照组和实验组的血清乳酸含量均低于空白组,乳酸增加水平空白对照组>阳性对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组;在休息20 min后,各组的血清乳酸含量据有所下降,与空白组相比,阳性对照组和低剂量组差异显著(p<0.05),中、高剂量组差异极显著(p<0.01)。乳酸在机体内的含量与疲劳程度呈正相关,其浓度水平既是引发疲劳的一个重要因素,也是评价机体有氧代谢能力和疲劳程度的敏感指标[19-21]。蜜环菌多肽对小鼠运动后血清中乳酸含量表现出一定的抑制作用,从而能够提高其抗疲劳能力。

表8 蜜环菌多肽对小鼠乳酸含量的影响(mmol/L)Table 8 Effects of ALP on lactic acid content of mice(mmol/L)

2.6.7 对小鼠乳酸脱氢酶活力的影响 由表9可知,各实验组小鼠在游泳前LDH活性无明显差异,在游泳20 min后,阳性对照组、低剂量组与空白组相比LDH活性差异显著(p<0.05);中、高剂量组与空白组相比差异显著(p<0.01)。运动产生的乳酸可以被乳酸脱氢酶所清除,乳酸脱氢酶活性的增强可以加快乳酸的清除,减少乳酸的累积,提高机体抗疲劳能力[22]。蜜环菌多肽可以显著提高LDH活性,从而加快清除无氧糖酵解生成的乳酸,减少乳酸在体内的累积,延缓疲劳的产生或加速疲劳的消除。

表9 蜜环菌多肽对小鼠乳酸脱氢酶活性的影响(U/L)Table 9 Effects of ALP on LDH of mice(U/L)

3 结论

经过响应面法优化,最优水解条件为底物浓度7.4%,加酶量1300 U/g,酶解温度51 ℃,酶解时间4.6 h,水解度为35.61%。通过动物实验对蜜环菌多肽的抗疲劳活性进行了考察,结果表明蜜环菌多肽对小鼠的自然生长情况无影响,蜜环菌多肽能够显著延长小鼠力竭游泳时间、降低游泳后血乳酸和血清尿素氮含量、增强乳酸脱氢酶活力、提高肝糖原和肌糖原含量。蜜环菌多肽能快速清除疲劳所产生的血乳酸和血清尿素氮,加速疲劳的消除,并且该作用呈现剂量依赖性。

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OptimizationofenzymatichydrolysisofArmillariamelleaVahlexFrpeptidesbyresponsesurfacemethodologyanditsanti-fatigueability

YUHuan,LILu,WANGSi-shuang,MALi-ying,LIUQiu-shuang,ZHONGBing-chang,ZHANGHui-feng*

(College of Pharmacy,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ArmillariamelleaVahl exFr was obtained by enzymatic hydrolysis withArmillariamelleaVahl exFr powder as raw material. The preparation process of walnut peptide was optimized on foundation of single factor experiment,according to Box-behnken central composition design principle,the method of response surface analysis was adopted with the degree of hydrolysis as the response value. The effect of concentration of substrate,enzyme dosage,time and temperature on the degree of hydrolysis were studied in this paper. Fatigue model was established by swimming test. Effects ofArmillariamelleaVahl exFr Peptides on swimming time,liver glycogen,muscle glycogen,serum urea nitrogen,lactic acid,LDH were determined. The rusults showed that the optimum preparation conditions were obtained as follows:concentration of substrate 7.4%,enzyme dosage 2%,time 4.6 h and temperature 51 ℃,the degree of hydrolysis was 35.61%,which was close to the theoretical value. Take the middle dose group as an example,compared to the blank group,theArmillariamelleaVahl exFr Peptides increased content of liver glycogen and muscel glycogen 109.01% and 58.33%,reduced metabolic product of LA and BUN levels 36.99% and 30.33%,increased LDH activities 9%,their differences were significant(p<0.05). TheArmillariamelleaVahl exFr Peptides has the function of anti-fatigue obviously.

ArmillariamelleaVahl exFr;response surface methodology;anti-fatigue;peptide

2017-05-22

于欢(1984-),男,博士研究生,研究方向:生物活性物质,E-mail:yuhuanjlu@163.com。

*通讯作者:张慧锋(1980-),女,博士,副教授,研究方向:生物活性物质,E-mail:76777303@qq.com。

吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(吉教科合字[2015]第379号);吉林医药学院大学生创新训练项目(2016049)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0085-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.018