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Nisin对印度树胶可食性膜性能的影响

2017-12-18,,,*

食品工业科技 2017年23期
关键词:食性铜绿单胞菌

,,,*

(1.山东理工大学实验管理中心,山东淄博 255000;2.山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东淄博 255000)

Nisin对印度树胶可食性膜性能的影响

赵亚1,张平平2,石启龙2,*

(1.山东理工大学实验管理中心,山东淄博 255000;2.山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东淄博 255000)

为提高印度树胶(GG)可食性膜的抑菌性能,以乳酸链球菌素(Nisin)为抑菌剂,研究了Nisin的最低抑菌浓度及其抑菌能力;探讨了Nisin添加量对GG可食性膜的抑菌特性、物理特性、力学性能与微观结构的影响。结果表明,Nisin对金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌(G+菌)的抑菌效果优于对变形杆菌、大肠杆菌与铜绿假单胞菌(G-菌)。GG膜对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌与铜绿假单胞菌的抑菌效果随着Nisin的添加而增加,但GG膜对大肠杆菌的抑菌效果受Nisin影响较小(p>0.05)。GG膜的厚度、表面疏水性与水蒸汽透过率随Nisin添加量的增加而降低,Nisin添加量显著影响膜的拉伸应力,而Nisin添加对膜的断裂伸长率影响较小(p>0.05)。本文可为GG膜在食品贮藏保鲜中的应用提供理论依据。

可食性膜,乳酸链球菌素,抑菌特性,物理特性,力学性能

微生物生长繁殖是导致生鲜食品腐败的主要原因之一。可食性涂膜保鲜技术因其有效降低食品表面微生物的生长、延缓食品腐败变质而逐渐成为人们关注的焦点。Rooney[1]研究表明,可食性膜具有抑制微生物生长与降低pH的能力,能够改善食品表面环境,减少微生物污染,延长食品的货架期。可食性抑菌膜是在可食性成膜基质中加入天然抑菌类物质,使其持久防止和抑制多种腐败菌的生长[2]。天然抑菌类物质中研究较多的是植物精油,尽管其具有较好的抑菌能力,但其中的芳香味物质会影响食品的感官特性。因此,选取一种既具有较好抑菌活性又不会影响产品风味的天然抑菌剂对可食性抑菌膜的制备至关重要。乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、无毒的天然食品防腐剂。关于Nisin抑菌机理,Engelke等[3]提出了“孔道形成”理论,即:Nisin可吸附于敏感菌细胞膜上,其C末端侵入膜内形成通透孔道导致细胞膜去极化以及ATP的流失,造成细胞内溶质渗出,细胞自溶而死亡。吕淑霞等[4]认为Nisin的作用位点为细胞膜,能够破坏细胞膜的完整性。Zhang等[5]研究了不同塑化剂类型和浓度对印度树胶膜特性的影响,结果表明:塑化剂类型与浓度显著影响膜特性,甘油塑化效果优于山梨醇,印度树胶在可食性膜的制备上有很好的应用前景。基于此,本文以印度树胶、甘油为成膜原料,Nisin为抑菌剂,研究不同Nisin添加量对膜的抑菌性、水蒸气透过率、表面疏水性与力学性能的影响,为可食性抑菌膜在食品保鲜中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

印度树胶(GG)、Nisin(食品级) 购于上海权旺生物科技有限公司;菌种:大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变形杆菌(Proteusvulgaris)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) 山东理工大学生命科学学院提供;牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,氯化钠5,蒸馏水定容至1 L,pH7.4~7.6;牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,氯化钠5,琼脂粉18,蒸馏水定容至1 L,pH7.4~7.6;2种培养基均在温度121 ℃下高压灭菌20 min,待用。

VS-840-1洁净工作台、YXQ-LS-75S11立式压力灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;THI-98A恒温振荡箱、DHG-9140A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;T18 basic型高速分散机 德国IKA公司;1HP-5冷风干燥实验机 青岛欧美亚科技有限公司;SK3310LHC超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;游标卡尺 无锡锡工量具有限公司;WSC-S测色色差计 上海仪电物理光学仪器有限公司;JGW-360A接触角测定仪 承德市成惠实验机有限公司;Instron 5969型万能材料实验机 美国Instron公司;Sirion200扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 用无菌接种环从固体斜面培养基上挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌种子,接种到液体培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中富集培养24 h[6]。通过平板菌落计数得到菌落生成单位数为106CFU/mL的种子液,用于抑菌性实验。

1.2.2 Nisin最低抑菌浓度 参照Iturriaga等[6]方法,略作改动。用无菌水配制质量浓度分别为12.5、25、50、100、200 mg/mL的Nisin溶液,各取1 mL注入无菌培养皿中,然后倒入9 mL冷却后的牛肉膏蛋白胨固体培养基,混匀,静置凝固后,取0.1 mL菌落数为106CFU/mL的菌液注入培养基并使其均匀分布于表面,干燥5 min后,37 ℃培养24 h。以完全没有菌落生长的最低浓度为Nisin最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.3 Nisin抑菌性能 采用滤纸片法。取1 mL细菌培养液(含菌量为106CFU/mL)注入培养基中,涂布平板后干燥5 min。在培养基中放置灭菌后的直径为6 mm的滤纸片,吸取不同浓度的Nisin溶液5 μL均匀滴入滤纸片表面,以无菌水作为对照组,干燥5 min后,37 ℃培养24 h,测定抑菌圈直径,每组做3个平行,结果取平均值。

1.2.4 膜的制备 参照Zhang等与Ali等[5,7]方法。将质量浓度为7.5 g/L的GG溶液40 ℃加热60 min,冷却至室温。以GG固形物计,添加质量分数为30%的甘油并搅拌均匀,然后添加质量分数分别为0%、5%、10%、15%的Nisin,超声波处理30 min,50 mL膜溶液倒入直径为12 cm培养皿中,置于冷风干燥实验机中,25 ℃干燥24 h,揭膜后于25 ℃、53%相对湿度(RH)下平衡2 d,用于膜性能测定。

1.2.5 膜的抑菌特性 采用抑菌圈法[8]。取1 mL细菌培养液(含菌量为106CFU/mL)注入培养基中,涂布均匀,干燥5 min。在培养基上贴直径为6 mm含有不同Nisin添加量的抑菌膜,以不添加Nisin的膜为对照组,37 ℃培养24 h,测抑菌圈直径,每组做3个平行,结果取平均值。

1.2.6 膜的物理特性测定

1.2.6.1 厚度 将膜折成4层,采用游标卡尺选4个点测其厚度,求平均值D。

1.2.6.2 接触角 参照Jouki等[9-10]方法,略作改动。将膜裁成4 cm×4 cm,用微量进样器吸取5 μL蒸馏水进行实验。0°为液体,180°为绝干物体。接触角越大,表面疏水性越强;反之,接触角越小,亲水性越强。每个膜样品做6次平行实验。

1.2.6.3 水蒸汽透过率 参照ASTM法测定[11]。将干燥器底部放入NaCl饱和溶液(25 ℃时,NaCl饱和盐液平衡相对湿度为75%)。称取3.00 g烘干后的CaCl2,放入完全干燥的称量瓶中。将膜紧密覆盖在瓶口,并用石蜡膜固定,放入盛有NaCl饱和盐液的干燥器中,每隔2 h称一次质量。

膜的水蒸汽透过率(water vapor permeability,WVP)按以下公式计算[9,11]:

式(1)

式中:D为膜厚度,mm;A为膜的面积,m2;Δm/Δt为膜在单位时间内的质量变化,g/h;ΔP为膜两侧的水蒸气压差,1.75355×103kPa。

1.2.6.4 力学性能 力学性能包括拉伸应力(tensile strength,TS)和断裂伸长率(elongation at break,EAB),参照ASTM法测定[11]。将膜裁成1×10 cm2,设定夹距为5 cm,拉伸速度为1 mm/s。每组至少重复5次。TS与EAB的计算方法如公式(2)、(3)所示[12]:

式(2)

式(3)

式中:F为膜断裂时的最大张力,N;L为膜的厚度,mm;W为膜的宽度,mm;l1为膜断后的长度,mm,l0为膜断裂前的长度,mm。

1.2.6.5 色泽 膜的色泽采用色差计测定。膜的色差(ΔE)与白度指数(WI)值的计算方法见公式(4)和(5)[9]:

式(4)

式(5)

式中:L、a和b为膜的参数值,L*、a*和b*为标准白板的值。

1.2.7 膜结构扫描电镜分析 GG膜在45 ℃下干燥12 h。用刀将膜裁成2 mm×2 mm,分别以水平和垂直方向固定在样品台上,真空状态下镀金15 min。将样品放入扫描电子显微镜中抽真空20 min,观察膜的表面结构和截面结构[14]。

表2 Nisin质量分数对GG膜抑菌性能的影响Table 2 Effect of Nisin mass fraction on antimicrobial activity of GG films

注:“-”表示无抑菌效果。

1.3 数据分析

实验数据采用平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 Nisin的最低抑菌浓度

MIC是测定抗菌剂抗菌活性大小的指标,测定Nisin的MIC,可为制备GG抑菌膜提供理论基础。如表1所示,Nisin对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌的MIC的分别为100、50、200 mg/mL,而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌虽然起到抑制作用,但其MIC明显高于其它3种供试菌。根据MIC值可初步判断Nisin对5种供试菌的抗菌活性大小为:枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>变形杆菌,对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性最小。

表1 Nisin的最小抑菌浓度Table 1 MIC of Nisin obtained by mixed culture method

注:“空白”为无菌水,“-”表示无菌生长,“+”表示菌体生长弱,“++”表示菌体生长较强,“+++”表示生长很强。

2.2 Nisin的抑菌能力

图1为Nisin对5种供试菌抑菌能力的测定结果。可以看出,对照中各供试菌生长良好(滤纸片直径为6 mm)。Nisin浓度为50~200 mg/mL时,对5种供试菌均表现出较好的抑菌效果,且抑菌效果随Nisin浓度增加而逐渐增强。当Nisin浓度为200 mg/mL时,抑菌圈直径达到最大。此时Nisin对5种供试菌抑菌圈直径大小为:金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>变形杆菌>大肠杆菌>铜绿假单胞菌。这是由于Nisin对革兰氏阳性菌(G+)的抑菌效果高于革兰氏阴性菌(G-)。G+和G-菌在结构上的差异主要表现在细胞壁结构上。G+菌细胞壁厚,肽聚糖含量丰富,但组成简单;而G-菌的细胞壁比G+菌薄,肽聚糖含量少,但层次多且成分复杂,仅允许分子量小于600 Da的分子通过[4]。Nisin的分子量为3500 Da左右,无法正常通过革兰氏阴性菌细胞壁作用于细胞膜使细菌裂解[4]。因此,Nisin对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌(G+菌)的抑菌效果优于对变形杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌(G-菌)的抑菌效果。

图1 Nisin浓度对抑菌能力的影响Fig.1 Effect of Nisin concentration on antimicrobial activity of tested bacterias

2.3 Nisin添加量对膜抑菌性能的影响

抑菌剂的添加量会影响可食性膜的抑菌性[15]。Nisin添加量对GG膜抑菌性能的影响如表2所示。可以看出,GG膜本身对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用,而对其它4种供试菌抑制作用不明显,其原因有待于进一步研究。随Nisin添加量的增加,当膜与细菌直接接触24 h后,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径逐渐增大;当Nisin添加量增加至15%时,抑菌圈直径分别达到最大值。但Nisin的添加并没有影响膜对大肠杆菌的抑菌效果,其原因有待于进一步研究。根据Nisin对5种供试菌的MIC值和抑菌能力的研究结果,Nisin对G+菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)的抑菌活性要明显高于G-菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)。由此可知,Nisin添加到GG膜中时,膜对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性要明显低于其它3种菌。

2.4 Nisin添加量对膜物理性能的影响

表3 Nisin质量分数对GG膜物理性能的影响Table 3 Effect of Nisin mass fraction on physical properties of GG films

注:同一列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

Nisin添加量对膜物理性能的影响如表3所示。可以看出,随Nisin添加量的增加,膜的厚度从0.040 mm逐渐降低到0.033 mm,但Nisin添加量0~10%、5%~15%范围内时,膜厚度随Nisin添加量变化不显著(p>0.05),这说明Nisin添加量会降低膜的厚度,但降低幅度不显著,这可能是由于Nisin分子与GG膜基质分子间键合,导致膜结构更为紧实,因此厚度降低,这需要进一步探讨。

接触角大小反映膜的亲水性强弱[9]。如表3所示,随Nisin添加量的增加,膜的接触角值由73.25°降到68°,表明膜的亲水性有所增强。可能原因:Nisin作为一种小分子多肽,可与GG膜基质相容,其分子中的极性基团可打破GG膜中的大分子结构,使更多的亲水基团暴露,故当接触水分子时能迅速吸收水分子,从而导致接触角值降低[9-10];Nisin比GG的亲水性更强,这需要进一步验证。GG膜的接触角值均低于90°,说明膜具有部分润湿性。

WVP是可食性膜的重要特性之一,膜的WVP值越小,阻湿性能越好。阻湿性决定了包装材料能否达到预期的包装效果[16-17]。如表3所示,与对照组相比,添加Nisin的膜的WVP值要低于对照组膜,但差异不显著,只有添加15% Nisin的膜的WVP值显著低于对照组膜。整体来看,随Nisin添加量的增加,WVP值呈逐渐降低的趋势,当Nisin添加量为15%时,WVP达到最小值4.187×10-11g/ms Pa。影响膜WVP的因素包括膜厚度、对水分子敏感性、微观结构如结晶度[18]。Nisin的加入打破了原有的分子结构,形成了更多分子间相互作用力,得到更加坚固的晶态结构,所以WVP值降低[18]。相关研究表明,膜结构中的亲水、疏水基团比例是影响WVP的因素之一,一般来说,亲水基团越多,膜的亲水性就越强,但膜的WVP值与亲水性的关系并不一定呈正相关。Aguirre等[15]研究表明,黑小麦蛋白膜的WVP值随牛至精油添加量的增加呈上升的趋势,但差异不显著(p>0.05)。Atarés等[19]对添加肉桂精油和生姜提取物的大豆分离蛋白膜的相关特性进行了研究,结果表明,两种精油的添加并不能显著降低膜的WVP值。刘婧等[20]以尼泊金酯为抑菌剂、壳聚糖为成膜基质,研究了尼泊金酯添加量对共混膜相关特性的影响,得出WVP值随尼泊金酯浓度的增大呈先降低后升高的趋势。综上,可以看出,膜的WVP受到膜基质种类、添加物成分与浓度等因素影响,这些因素导致膜无定形/结晶态、亲水/疏水基团比例改变,进而影响膜WVP值。

膜的颜色是影响其应用的一个重要因素,而塑化剂、成膜条件和贮藏环境是影响膜颜色的重要因素。GG膜的色泽参数如表3所示。a值随Nisin添加量增加显著降低,b值则随Nisin添加量增加显著增加,但是Nisin添加对膜L值无显著影响。Nisin添加量可使膜的ΔE值显著增加,WI值显著降低。这可能是由于Nisin进入GG膜基质中,使膜的内部结构发生改变致使膜内组分的折射率发生改变,从而影响了膜的色泽。

图2 Nisin质量分数对GG膜力学性能的影响Fig.2 Effect of Nisin mass fraction on mechanical properties of GG films

2.5 Nisin添加量对膜力学性能的影响

TS和EAB是评价包装材料力学性能的重要指标,包装材料需要具有一定的机械强度才能承受流动过程中的压力,塑化剂、抑菌剂、抗氧化剂等成分的添加会对膜的力学性能造成不同程度的影响[21]。图2为Nisin添加量对GG膜力学性能的影响。可以看出,膜的TS随Nisin添加显著增加至最大值,继而随着Nisin添加量增加而降低;膜的EAB值随Nisin添加的增加变化不明显(p>0.05)。成膜基质、成膜条件以及抑菌剂种类不同,添加物对膜特性的影响效果也不同。赵丹[22]研究了天然抑菌类物质的添加对玉米淀粉膜特性的影响,结果表明,壳聚糖、溶菌酶和肉桂精油的添加能有效提高膜的TS值和EAB值。邹小波等[23]研究了不同来源的花青素对壳聚糖明胶复合膜相关特性的影响,结果表明添加25%玫瑰花青素的膜具有最高的拉伸强度值和最低的断裂伸长率值,分别为27.03 MPa和37.66%。

2.6 Nisin添加量对膜微观结构的影响

膜的微观结构反映了膜的均一性和致密性,一般而言,膜的均一性和致密性越高,其抗拉强度就越高[21,24]。根据图3膜的表面形貌,可以看出,所有膜的表面都是均匀、光滑、连续的,没有明显的裂痕和孔洞出现。从膜的横截面结构来看,所有膜都具有紧密而均一的横截面形态,添加Nisin的膜的截面比对照组更加紧实,说明Nisin与膜的相容性很好。

图3 Nisin质量分数对膜微观结构的影响Fig.3 Effect of Nisin mass fraction on micro structure of GG films注:(a)对照膜表面;(b)对照膜截面;(c)10% Nisin-GG膜表面;(d)10% Nisin-GG膜截面。

3 结论

Nisin的添加对GG膜的性能影响存在差异。添加Nisin可显著提高GG膜的抑菌能力(p<0.05),降低膜的厚度、表面疏水性及WVP值。GG膜TS随Nisin添加呈先增加而后降低趋势(p<0.05),但EAB随Nisin添加无显著变化(p>0.05)。膜的b与ΔE值随Nisin添加量的增加而升高,而a与WI值则随Nisin添加量的增加而降低(p<0.05);但L值随Nisin添加无显著变化(p>0.05)。Nisin与GG分子具有较好的相容性。Nisin可用于制备可食性抑菌膜。

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《食品工业科技》

愿为企业铺路、搭桥!

EffectofNisinonthepropertiesofediblefilmspreparedbygumghatti

ZHAOYa1,ZHANGPing-ping2,SHIQi-long2,*

(1.Experiment Management Center of Shandong University of Technology,Zibo 255000,China;2.School of Agricultural Engineering and Food Science,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China)

In order to increase the antibacterial ability of gum ghatti(GG)film,lactic acid streptococcus(Nisin)was selected as a natural antibacterial agent in the test,and its minimum inhibitory concentration(MIC)and antibacterial ability were determined. The effect of Nisin on the antibacterial properties,physical properties,mechanical properties and microstructure were determined and analyzed. As a result,Nisin had better ability in inhibitingStaphylococcusaureusandBacillussubtilis(gram positive bacteria)than that ofProteusvulgaris,EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosabacteria(gram negative bacteria). The antibacterial effect of GG film onStaphylococcusaureus,Bacillussubtilis,BacillussubtilisandPseudomonasaeruginosaincreased with the increase of Nisin,but not obvious effect was observed onEscherichiacoli. The thickness,surface hydrophobicity and water vapor permeability(WVP)values of films decreased with increasing Nisin concentration. Nisin concentration had significantly effect on tensile stress. However,Nisin concentration had little effect on the elongation at break of GG film(p>0.05). The results will provide theoretical basis for the application of GG edible film in food storage and preservation.

edible film;Nisin;antimicrobial property;physical property;mechanical property

2017-05-09

赵亚(1974-),女,硕士,实验师,研究方向:农产品加工与贮藏,E-mail:zy0028014@sdut.edu.cn。

*通讯作者:石启龙(1974-),男,博士,教授,研究方向:果蔬/水产品加工与贮藏,E-mail:qilongshi@sdut.edu.cn。

TS206.4

A

1002-0306(2017)23-0069-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.015

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